间充质干细胞来源外泌体修复创伤性脊髓损伤

周 丽，孔彦龙，陶欣荣

(安徽理工大学医学院，安徽 淮南 232000)

创伤性脊髓损伤(Traumatic Spinal Cord Injury, TSCI)在交通事故以及高空坠落伤中常见，极易引起瘫痪等并发症，且难以治愈，给患者、家属及社会带来巨大的经济和心理负担。1992年，大剂量甲基强的松龙冲击疗法首次被用于治疗急性TSCI，并被推广应用，但由于严重的副作用限制了其作用的发挥。后来研究发现移植骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells, BMSCs)、脐带间充质干细胞(Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells, UCMSCs)、胚胎干细胞等能够减少神经细胞死亡，促进髓鞘再生，有利于感觉运动功能的恢复，但也因为伦理等问题影响了其进一步研究。有学者将间充质干细胞产生的外泌体(exosomes, Exo)通过尾静脉移植到TSCI小鼠体内，观察到明显的损伤修复作用，这和移植间充质干细胞的修复效果相似，而且没有出现细胞移植的各种弊端，显示出间充质干细胞来源的外泌体(MSCs-Exo)治疗TSCI的巨大潜力，但是MSCs-Exo促进损伤修复的机制仍未完全阐明。此外，虽然在不同的实验中都显示出一定的损伤修复作用，但是移植MSCs-Exo的途径、移植剂量和移植时间与损伤修复作用之间的关系尚缺乏足够的关注。因此本文通过近些年国内外发表的相关文献对上述问题以及MSCs-Exo促进TSCI修复的可能机制进行阐述。

1 MSCs-Exo移植

1.1 移植途径

目前TSCI的试验中移植MSCs-Exo的方法主要有三种，即静脉注射、鼻腔给药和损伤局部应用。静脉移植的实验中主要采用尾静脉注射，文献[7]将MSCs-Exo通过尾静脉注射到模型鼠体内后，观察到促凋亡蛋白(Bax)和促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β)的表达水平降低，但抗凋亡蛋白(Bcl-2)和抗炎细胞因子(IL-10)的表达量明显升高，且在注射后第7d后肢运动功能评分(BBB评分)与对照组出现显著性差异。文献[8]将标记的MSCs-Exo分别经鼻腔和损伤局部给药，24h后通过Micro-CT观察损伤部位的荧光强度，发现损伤局部给药组荧光更强，在第14d BBB评分与对照组出现差异，而且在28d的试验周期中，虽然两种移植途径都能够产生修复效果，但是最后还是以损伤局部应用引起的运动能力改善更加明显。所以，通过以上3种途径移植MSCs-Exo均能够对TSCI产生修复效果。尾静脉移植实验操作相对简便，是目前最常用的移植途径，不过注射到体内的MSCs-Exo要经历体循环过程和血脊髓屏障(Blood-Spinal Cord Barrier,BSCB)，会降低到达损伤部位的MSCs-Exo的量，但是目前尚没有这方面的研究。而鼻腔移植的优势在于能够使EX更快通过BSCB，且避免了体循环过程，似乎是比较理想的移植途径，但在移植过程中真正进入体内的MSCs-Exo的量无法确定，存在很多不确定性，限制了其被广泛采用。在上述尾静脉注射和鼻腔给药的实验中可看到，理论上能够更快通过BSCB的鼻腔给药组却比尾静脉注射组的运动功能改善效果差，原因可能就是鼻腔给药过程中损失掉了一部分MSCs-Exo，导致透过BSCB到达损伤部位的MSCs-Exo总量减少，因此影响了修复效果。损伤局部应用在上述实验中表现出良好的修复作用，但是由于存在二次损伤等风险限制了其使用。从上述实验中能够看出移植途径对运动功能改善的影响，但是仍缺乏有力的证据，后续研究中应该关注此部分的探索。

1.2 移植剂量

当前有关移植MSCs-Exo的剂量没有明确的规定。文献[9]通过尾静脉注射的剂量为100μg MSCs-Exo蛋白，在第7d观察到运动功能改善。但在相同的剂量下，文献[10]在第14d观察到运动功能改善。而文献[11]、文献[12]注射的剂量为200μg BMSCs-Exo蛋白，前者在第7d观察到运动功能改善，后者在第14d观察到运动功能改善。文献[13]注射的剂量则为100mg BMSCs-Exo蛋白，在第7d观察到运动功能改善。文献[8]在鼻腔给药和局部给药的过程中应用的剂量均为40μg BMSCs-Exo蛋白，前者在第14d首先观察到短暂的运动功能改善，后者运动功能改善出现较晚但是功能恢复更加明显。由上述实验可知即使移植剂量相同，实验结果也不完全相同，这可能与移植途径以及移植次数和时间等有关。此外，不同的移植途径中，静脉移植相对于鼻腔给药和局部应用需要的剂量更大。但是这不能掩盖现阶段对于移植MSCs-Exo的剂量尚没有统一量化标准的事实。目前的实验主要通过测定MSCs-Exo中的蛋白含量来量化外泌体的移植剂量，但通过前期研究可知MSCs-Exo中有很多不同的成分，文献[14]通过高通量测序和液相色谱-质谱/质谱蛋白质组学在猪脂肪间充质干细胞来源的外泌体中检测出4种 miRNA、255种 mRNA和277 种蛋白质，在蛋白质中就含有能够促进轴突生长的肝细胞生长因子和转化生长因子β等。文献[15]在BMSCs-Exo中检测出各种粒细胞集落刺激因子、IL-6等能够抑制炎症反应的成分，可见外泌体的成分非常之复杂。MSCs-Exo中含有的RNA对脊髓损伤也有一定的修复作用，文献[16]将富含miR-25的BMSCs-Exo移植到脊髓损伤小鼠后观察到小鼠运动功能的改善。所以，单纯通过蛋白含量定量MSCs-Exo的方法就有失科学性，而且MSCs产生Exo的量和MSCs的状态也有一定关系，因此在定量MSCs-Exo的问题上还需要深入研究。

1.3 移植时间

TSCI后移植MSCs-Exo的最佳时间尚没有专门研究过，在已有实验中造模成功0h、0.5h、1h、3h、24h或7d移植MSCs-Exo都有报道，不同实验中模型鼠的感觉运动功能均出现不同程度的改善，但是以3h以内移植 MSCs-Exo的实验组感觉运动功能恢复更加明显，在7d左右就出现了后肢BBB评分的升高。在TSCI的病理生理变化中有学者提到，脊髓损伤后1hTNF-α水平升高、2～3h白三烯和血栓素等其他炎性细胞因子水平升高5～9倍，因此，在SCI后3h以内是降低损伤部位炎症水平的最佳时期。而在上述研究中也发现3h以内移植MSCs-Exo能够取得非常明显的神经功能恢复，两者的结论相互吻合。另一方面，运动功能恢复快慢似乎和治疗的持续时间也有关系，文献[8]对注射1次载有张力蛋白同源物小干扰RNA的MSCs-Exo(Exo-PTEN)和注射5次Exo-PTEN的TSCI小鼠模型进行比较，8周后发现注射5次的模型鼠运动功能明显改善，BBB评分7.75±2.14，注射1次的模型鼠BBB评分2.50±1.21，而且感觉恢复也以注射5次的ExoPTEN组最为明显。这些结果提示移植MSCs-Exo治疗TSCI可能需要多次治疗而不是目前很多研究中采用的单次治疗。所以，在移植MSCs-Exo治疗TSCI时最佳的治疗时间是在损伤后3h内开始治疗，并且进行多次治疗。

2 MSCs-Exo促进TSCI修复可能机制

2.1 抑制神经细胞凋亡

TSCI后损伤部位的水肿、出血等能够使神经细胞死亡，随后引起的损伤部位细胞因子、miRNAs等的变化进一步加重了神经细胞凋亡。有研究显示，脊髓损伤后损伤部位大约有30种miRNA的含量发生了变化，例如miR-133b和miR-124的下调，miR-20和miR-103的上调。另外还有研究表明脊髓损伤后谷氨酸(GLU)大量存在于损伤的神经元周围，这是导致神经细胞凋亡的重要原因之一。文献[26]在体外实验中观察到MSCs-Exo能够抑制GLU引起的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的凋亡，并且使促凋亡蛋白，如Bax、活化的caspase-3和caspase-9含量降低，而抗凋亡蛋白Bcl-2等含量增加，在体内实验中，将MSCs-Exo直接注射到SCI损伤部位，在治疗后第1d就观察到神经细胞凋亡率降低，同时也观察到和体外实验中相同的蛋白水平变化，并且对TSCI区域进行TUNEL染色后发现实验组损伤区域TUNEL阳性细胞与对照组相比明显减少，实验组SCI模型的运动功能得到了很大改善。文献[27]将转染了miR-21基因的BMSCs-Exo进行体内外实验，发现富含miR-21的Exo在体外能够抑制人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y cells)中程序性细胞死亡蛋白4(PDCD4)和张力蛋白同源物(PTEN)的表达，在TSCI模型鼠中也观察到了PDCD4和PTEN 表达量的下降，并且PTEN下游PI3K非依赖性和PI3K依赖性信号通路被激活，促进了髓鞘的形成和轴突的再生。所以，MSCs-Exo能够通过调整SCI损伤部位微环境中不同成分的含量抑制神经细胞凋亡，促进神经功能恢复。

2.2 抑制神经毒性星形胶质细胞增生

TSCI后A1型神经毒性星形胶质细胞增生，并大量分泌硫酸软骨素蛋白多糖、压迫损伤部位、抑制轴突再生，同时，分泌大量促炎介质，如白三烯、肿瘤坏死因子ɑ(tumor necrosis factor ɑ，TNF-ɑ)、降钙素基因相关肽calcitonin gene related peptide，CGRP)等增强感觉神经末梢伤害性神经递质的释放，严重影响神经功能恢复。 文献[6]将BMSCs-Exo注射到模型鼠体内，观察到A1型胶质细胞比例、星形胶质细胞中p65阳性细胞核百分比和前角TUNEL阳性细胞百分比均出现下降，病变面积缩小，TNF-ɑ、白细胞介素-1α (interleukin-1ɑ，IL-1ɑ)和IL-1β表达量减少，髓鞘碱性蛋白、突触素和神经元核表达增加，模型鼠的BBB评分提高和斜板角度增大，因此推测BMSCs-Exo通过抑制星形胶质细胞NFκB的核转位减少了TSCI后A1型神经毒性星形胶质细胞数量，促进了TSCI修复。文献[11]通过同样的方法将MSCs-Exo注射到模型鼠体内后也观察到A1神经毒性反应性星形胶质细胞的激活被抑制，运动功能得到了明显改善，不仅如此，还发现毒性星形胶质细胞增生被抑制后TSCI部位胶质瘢痕的形成减少，神经再生增强。因此，抑制神经毒性星形胶质细胞增生，减少胶质瘢痕形成是MSCs-Exo促进TSCI修复的又一重要作用。

2.3 免疫调节

免疫系统是维持机体稳态的重要部分，一直以来都是研究的重点。将脐带间充质干细胞来源的外泌体 (UMSCs-Exo) 通过尾静脉注射到TSCI小鼠体内，发现损伤部位的促炎性M1型巨噬细胞的数量和促炎细胞因子如 TNF-ɑ、IL-6、Interferon-β(IFN-β)、Granulocyte colony-stimulating factor、Monocyte chemoattractant protein-1和Macrophage inflammatory protein 1ɑ明显减少，而抗炎性M2型巨噬细胞的数量和抗炎细胞因子如IL-4和IL-10 明显增加。在另一个研究中将BMSCs-Exo通过尾静脉注射到TSCI小鼠体内，免疫荧光检测显示损伤部位促炎型细胞因子如TNF-ɑ、IL-1ɑ、IL-1β和P65明显下调，减弱了对A1型毒性星形胶质细胞的活化，从而保护神经元、轴突和髓鞘。进一步将DIR荧光标记的BMSCs-Exo注入模型鼠体内，在注射后3h、24h分别检测损伤部位的荧光信号，发现损伤部位的M2型巨噬细胞胞质中高荧光信号，而AS、M1型巨噬细胞等均未检测到荧光信号，并且在小鼠的脾脏中也检测到了荧光信号，1周后称量脾脏发现，实验组小鼠脾脏的质量比阴性对照组脾脏的质量减轻了18%，这些结果表明免疫细胞以及免疫器官在MSCs-Exo介导的TSCI修复中发挥了巨大作用。

2.4 恢复BSCB完整性

创伤性脊髓损伤后BSCB的完整性遭受严重破坏，各种炎症因子和炎症细胞进入损伤区域，加速神经细胞和少突胶质细胞的死亡，扩大脊髓的损伤范围。文献[17]将BMSCs-Exo通过尾静脉注射到模型鼠体内后发现BMSCs-Exo能够抑制BSCB周围周细胞内NF-kB信号通路的激活，抑制周细胞的脱落和迁移，导致BSCB的通透性降低，模型鼠BBB评分与对照组相比明显提高，说明BMSCs-Exo能够保护损伤后BSCB的完整性，减轻损伤部位炎症反应，有利于运动感觉功能恢复。

3 结语

MSCs-Exo治疗TSCI展现出良好的疗效，MSCs-Exo不仅具有极低的免疫原性、易穿过BSCB，而且能够克服细胞移植存在的致瘤等风险。但该方法也存在很多不足，一方面，MSCs-Exo的最佳移植时间以及移植剂量等仍需探究；另一方面，MSCs产生Exo的效率比较低(106个MSCs每天可产生1～4μg Exo蛋白)，而且经胰蛋白酶消化传代15次以上的MSCs明显出现功能减退，表现为分泌Exo的量和Exo中含有的成分都出现变化。并且MSCs-Exo靶向性差，Exo的有效成分利用率低，针对MSCs-Exo产量低、靶向性差，目前已有研究，如文献[35]用氧化铁纳米颗粒(IONP)预处理人间充质干细胞(Human Mesenchymal Stem Cells，HMSCs)制备了仿外泌体纳米微囊(NV-IONP)，不仅使治疗性生长因子分泌增加，而且能够充当磁导导航工具，实现NV-IONP的靶向输送，增加治疗性生长因子在脊髓损伤部位的浓度，提高损伤修复能力。总之，MSCs-Exo为TSCI的治疗带来了曙光，有很好的研究前景和巨大的研究价值。