3 种鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白功能特性变化

姚 慧，祁雪儿，毛俊龙，齐 贺，武天昕，张 宾,2,

（1.浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316022；2.浙江海洋大学比萨海洋研究生学院，浙江 舟山 316022）

鱿鱼作为一种常见的营养健康且风味良好的远洋渔业资源，含有丰富的胶原蛋白、牛磺酸、维生素及多种人体必需氨基酸等，表现出明显的高蛋白、低脂肪及低热量特点，因而深受广大消费者的喜爱[1]。鱿鱼肌肉中肌原纤维蛋白含量较高，约占全部肌肉组织的60%～70%。在加工、贮藏及运输过程中肌肉中肌原纤维蛋白功能特性的变化情况显著影响着鱿鱼及其制品的感官价值及营养品质。冷冻贮藏作为鱿鱼制品的最常用保存方式，可有效保持鱿鱼肌肉的营养价值[2]。但有研究表明，随着冻藏时间延长，鱿鱼肌肉中水分含量逐渐降低，组织结构破损程度加剧，导致肌原纤维蛋白各种功能特性也不断减弱[3]，致使鱿鱼冻藏品质也不断下降。此外，低温贮藏过程中，肌肉组织中生成的冰晶促使水分子不断从蛋白质周围析出，从而影响肌原纤维蛋白浊度、溶解性、起泡性等功能特性[4-5]。

近年来，国内外钓捕产量较高的鱿鱼资源主要有阿根廷鱿鱼（Illex argentines）、北太平洋鱿鱼（Ommastrephes bartrami）（以下简称北太鱿鱼）、秘鲁鱿鱼（Dosidicus gigas）等。其中，关于单一种类鱿鱼中肌原纤维蛋白功能特性的变化研究较多，而对不同品种鱿鱼之间肌肉品质特性的比较研究还鲜见报道。综上，本实验以阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼为研究对象，分析冻藏对不同鱿鱼肌原纤维蛋白品质特性的影响情况，旨在为3 种鱿鱼冻藏过程中肌肉蛋白质冷冻变性（差异性）规律提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

阿根廷鱿鱼（体长约170 mm、质量400 g）、北太鱿鱼（体长约250 mm、质量500 g）和秘鲁鱿鱼（体长约300 mm、质量1 000 g）购自浙江舟山国际水产城。将新鲜鱿鱼样品置于装有冰块的保温箱内，0.5 h内运回实验室，备用。

氯化钠、氯化钾、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等（均为分析纯） 武汉谷歌生物科技有限公司；2,4-二硝基苯肼（2,4-dinitrophenyl-hydrazin，DNPH）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、磷酸氢二钠、十二烷基硫酸钠（dodecyl sodium sulfate，SDS）等（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；Ca2+-ATPase试剂盒、总巯基试剂盒 南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 仪器与设备

MDF-U53V型超低温冰箱 日本Sanyo公司；UV751GD型紫外-可见分光光度计 上海第三分析仪器厂；F-4500型荧光分光光度计、CF-16RN高速冷冻多用途离心机 日本日立公司；T18 ULTRA-TURRAX型高速匀浆机 德国IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 鱿鱼分组与取样

将新鲜阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼样品在-18 ℃冰箱中进行长期冻藏，第0、15、30、45、60、75、90、105天和第120天分别取样1 次，进行各指标测定。

1.3.2 肌原纤维蛋白制备及质量浓度测定

依据李学鹏等[6]的方法并加以修改。取5 g鱿鱼胴体搅碎，加入4 倍体积10 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH 7.2），高速均质20 s，然后在4 500 r/min条件下离心20 min；取沉淀再次均质1 次，加入4 倍体积10 mmol/L Tris-HCl缓冲液（含0.6 mol/L NaCl，pH 7.2）混匀均质，在4 500 r/min条件下离心20 min，取上清液即获得肌原纤维蛋白提取液，进而采用双缩脲法测定蛋白质量浓度[7]。

1.3.3 肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力测定

采用试剂盒测定肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力，具体方法参照说明书进行。Ca2+-ATPase活力以每毫克蛋白所含Ca2+-ATPase活力单位表示。

1.3.4 肌原纤维蛋白溶解度测定

参照刁小琴等[8]报道的方法。采用50 mmol/L磷酸盐缓冲液（含有0.6 mol/L NaCl，pH 6.2），将制备的肌原纤维蛋白溶液质量浓度调整为10 mg/mL，4 000 r/min离心40 min后，上清液用双缩脲法测定蛋白质量浓度，按式（1）计算肌原纤维蛋白溶解度。

1.3.5 肌原纤维蛋白浊度测定

依据Benjakul等[9]的方法，并稍作修改。取制备的肌原纤维蛋白溶液于烧杯中，加入磷酸盐缓冲溶液（含有50 mmol/L Na2HPO4、0.6 mol/L NaCl，pH 6.25）使肌原纤维蛋白溶液质量浓度为2 mg/mL，在80 ℃水浴锅中加热30 min，冷却后在340 nm波长处测定吸光度，以吸光度表示肌原纤维蛋白浊度。

1.3.6 肌原纤维蛋白乳化能力测定

参考Agyare[10]和Xia Xiufang[11]等的方法，并略作修改。将2.0 mL大豆油和8.0 mL肌原纤维蛋白溶液（1～2 mg/mL）置于50 mL离心管中，高速匀浆1 min；结束后从离心管底部0.5 cm处取出50 μL混合液，加入5 mL质量分数0.1% SDS溶液，混匀后在500 nm波长处测定吸光度。离心管继续放置10 min后，再次在相同位置取50 μL混合液，加入5 mL质量分数0.1% SDS溶液，混匀后测定吸光度，按式（2）和式（3）分别计算肌原纤维蛋白乳化活性指数（emulsification activity index，EAI）和乳化稳定性指数（emulsification stability index，ESI）。

式中：ρ为乳状液肌原纤维蛋白质量浓度/（mg/mL）；A0为0 min时乳状液的吸光度；A10为10 min时乳状液的吸光度；φ为油相体积分数（φ为0.2）；n为稀释倍数。

1.3.7 肌原纤维蛋白起泡性和泡沫稳定性的测定

参考Hammershøj等[12]的方法并略作修改。取30 mL肌原纤维蛋白溶液（20 mg/mL），高速匀浆机匀浆1 min；匀浆结束后将液体快速转入至量筒中，分别测定匀浆操作停止时的泡沫体积和液体体积之和V0，以及操作停止10 min后的泡沫和液体总体积V10，按式（4）和式（5）分别计算肌原纤维蛋白起泡性和泡沫稳定性。

式中：V0为匀浆0 min后泡沫体积和液体总体积/mL：V10为匀浆10 min后泡沫和液体总体积/mL。

1.3.8 总巯基含量测定

采用总巯基含量试剂盒法进行测定，具体操作依据说明书进行，总巯基含量以每毫克蛋白所含总巯基的物质的量表示。

1.3.9 羰基含量测定

依据Oliver等[13]的方法，并稍作修改。取5 mL 2.5 mg/mL肌原纤维蛋白溶液，加入5 mL 10 mmol/L DNPH溶液（含2 mol/L HCl），室温下避光反应1 h，每隔15 min振荡1 次；反应后加5 mL质量分数20% TCA溶液，混合后10 000 r/min离心5 min；取沉淀物用5 mL乙酸乙酯-乙醇混合液洗涤3 次，再加入10 mL 6 mol/L盐酸胍溶液，37 ℃水浴15 min后，10 000 r/min离心3 min，在370 nm波长处测定吸光度，计算肌原纤维蛋白羰基含量，羰基含量以每毫克蛋白所含羰基物质的量表示。

1.4 数据处理与分析

实验均重复3 次，结果均以平均值±标准差表示，采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白质量浓度的变化

图1 3 种鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白质量浓度变化情况Fig.1 Changes in myofibrillar protein contents in three squid species during frozen storage

由图1可知，阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼酮体肌肉中，肌原纤维蛋白初始质量浓度存在着较大差异，其中阿根廷鱿鱼肌原纤维蛋白初始质量浓度为105.22 g/L，高于其他两种鱿鱼，而北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼二者之间并无明显差异。随着冻藏时间延长，3 种鱿鱼肌原纤维蛋白质量浓度均呈现不断的下降趋势。冻藏120 d时，相比于冻藏0 d时，阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼中肌原纤维蛋白质量浓度较初始分别减少了72.22%、46.24%和40.83%，其中以阿根廷鱿鱼肌原纤维蛋白质量浓度下降幅度最大。对于阿根廷鱿鱼，在冻藏0～15 d范围内，其肌原纤维蛋白质量浓度明显下降；第15天时，比初始质量浓度减少33.53 g/L；在随后15～45 d范围内，其下降速率相对较为平缓，这可能是阿根廷鱿鱼中肌动球蛋白含量较高，冻藏过程中肌动球蛋白部分结合水形成冰晶，导致肌动球蛋白分子之间相互形成非共价键，进而形成超大分子的凝集体所致[14]。在冻藏60～120 d范围内，3 种鱿鱼肌原纤维蛋白质量浓度变化趋势较为相似，三者之间并无明显差异，表明在冻藏后期3 种鱿鱼中蛋白质的变性过程及变化程度相对较为一致。

2.2 鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力的变化

图2 3 种鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白Ca2＋-ATPase活力变化情况Fig.2 Changes in Ca2+-ATPase activity of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

Ca2+-ATPase活性是反映肌球蛋白结构完整程度的一个重要指标，其也能反映肌肉蛋白质的整体变性程度。由图2可知，3 种鱿鱼中初始肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力存在较大差异，其中阿根廷鱿鱼初始肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力为2.31 U/mg，明显高于其他两种鱿鱼。随着冻藏时间的延长，3 种鱿鱼中肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力均呈现不断下降的趋势。冻藏120 d后，阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼中肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力较初始分别下降了2.15、1.22 U/mg和1.20 U/mg，这是由于肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性主要源于肌球蛋白的球状头部，在冻藏过程中冰晶形成以及由此造成的体系离子强度升高，都会导致肌球蛋白头部结构发生改变，从而使Ca2+-ATPase活性下降。此外，低温冻藏诱导的蛋白质分子重排、冻结浓缩效应及肌球蛋白活性部位的巯基氧化作用，也会导致Ca2+-ATPase活性的降低[15]。在冻藏0～15 d范围内，阿根廷鱿鱼肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活力呈现急剧下降的趋势，这可能是因为阿根廷鱿鱼肌球蛋白含量较高[16]，其表现出的初始Ca2+-ATPase活性较高，在随后的低温冻藏过程中降低幅度也最为明显。在冻藏45～100 d范围内，北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼中肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性变化趋势较为相似；在此期间，阿根廷鱿鱼中肌原纤维蛋白Ca2+-ATPase活性始终高于其他两种鱿鱼。

2.3 鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白溶解性的变化

图3 3 种鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白溶解性变化情况Fig.3 Changes in solubility of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

蛋白溶解性是肌肉蛋白质重要的功能性质之一，对肌肉品质特性具有重要的影响。通常情况下，蛋白溶解性的下降也是肌肉品质劣变的重要标志[17]。由图3可知，阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白初始溶解度分别为68.87%、66.93%和69.73%，三者之间并无明显差异。冻藏120 d后，阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白溶解度分别下降至20.88%、32.93%和22.42%，其中以北太鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白溶解度保持效果较好，明显优于其他两种鱿鱼。3 种鱿鱼肌原纤维蛋白溶解性下降，是因为在冻藏过程肌原纤维蛋白发生变性或者通过二硫键等发生交联聚集，造成肌原纤维蛋白可提取性下降[18]。阿根廷鱿鱼在冻藏45 d时，比初始肌原纤维蛋白溶解度下降了39.81%，下降速率明显高于其他了两组鱿鱼，推测其原因可能是由于阿根廷鱿鱼冻藏过程中造成更多活性巯基暴露并氧化形成二硫键，同时造成更多的蛋白质变性解旋，使肌球蛋白重链聚合，降低其盐溶性。在0～120 d冻藏过程中，3 种鱿鱼肌原纤维蛋白溶解度整体变化趋势较为相似。

2.4 鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白浊度的变化

图4 3 种鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白浊度变化情况Fig.4 Changes in turbidity of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

蛋白质溶液加热后的浊度水平常用于表征溶液中蛋白质的聚集情况。冻藏对不同鱿鱼肌原纤维蛋白浊度的影响如图4所示。阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白初始浊度存在较大差异，其中北太鱿鱼初始肌原纤维蛋白浊度最低，为0.355，明显低于其他两种鱿鱼，且在整个贮藏过程中始终低于其他两种鱿鱼。冻藏120 d后，阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白浊度分别增加至1.303、0.608和1.177，表明随着冻藏时间延长，肌原纤维蛋白热诱导的聚集程度不断增强。在整个冻藏过程中，3 种鱿鱼肌原纤维蛋白浊度变化趋势较为相似。这是因为经长期冻藏后，鱿鱼肌原纤维蛋白中巯基在低温条件下氧化形成二硫键，同时肌原纤维蛋白表面疏水性不断增加，导致其加热时更容易发生聚集，使得肌原纤维蛋白溶液浊度增加[19]。冻藏120 d后，阿根廷鱿鱼肌原纤维蛋白浊度较初始增加了141.29%，明显高于其他两组，推测其原因可能是阿根廷鱿鱼肌原纤维蛋白含量较高，在加热后相互聚集导致颗粒直径较大，浊度升高幅度较大[20]。浊度分析结果与鱿鱼中肌原纤维蛋白质量浓度分析结果相互印证。

2.5 鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白乳化性的变化

图5 3 种鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白乳化活性（A）和乳化稳定性（B）变化情况Fig.5 Changes in emulsifying activity (A) and emulsion stability (B) of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

蛋白质乳化性指一定条件下蛋白质所能乳化油脂的能力，是表征蛋白质功能特质的重要指标之一。图5为3 种鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白EAI和ESI的变化情况，北太鱿鱼肌原纤维蛋白初始EAI为18.89 m2/g，明显高于其他两种鱿鱼，而秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白初始ESI最低，且在整个贮藏过程中一直低于阿根廷鱿鱼和北太鱿鱼。冻藏120 d后，阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白EAI较初始分别下降了10.09、15.48 m2/g和11.63 m2/g；冻藏120 d后，阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白ESI较初始分别下降了36.78%、46.85%和42.69%。低温冻藏过程中，3 种鱿鱼肌原纤维蛋白乳化性能均不断降低；在整个冻藏过程中，3 种鱿鱼肌原纤维蛋白EAI和ESI变化趋势较为相似。其原因可能是长期的低温环境破坏了鱿鱼肌原纤维蛋白结构的完整性，导致肌原纤维蛋白与脂肪交联能力不断下降，从而使其EAI及ESI显著降低[21]。从结果可以看出，在冻藏0～120 d范围内，无论是EAI还是ESI，北太鱿鱼肌原纤维蛋白的下降速度明显快于阿根廷鱿鱼和秘鲁鱿鱼。这可能是随冻藏时间延长，北太鱿鱼蛋白质氧化更加迅速，从而破坏蛋白质结构的稳定性，降低了蛋白与脂肪颗粒交联的能力，使蛋白质不能形成稳定的界面膜，导致其蛋白乳化能力比其他两组鱿鱼下降速率快。

2.6 鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白起泡性和泡沫稳定性的变化

起泡性是蛋白质搅打时捕捉气体形成泡沫的能力；泡沫稳定性指蛋白质泡沫维持的能力，即泡沫间液膜保持液体不析出的能力[22]。3 种鱿鱼冻藏过程中，肌原纤维蛋白起泡性及其泡沫稳定性的变化情况如图6所示。阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼中，初始的肌原纤维蛋白起泡性和泡沫稳定性存在一定差别，北太鱿鱼初始肌原纤维蛋白起泡性仅为50%，在3 种鱿鱼中起泡性最低。3 种鱿鱼肌原纤维蛋白的起泡性均随冻藏时间的延长而降低，而泡沫稳定性的变化趋势与起泡性变化趋势基本保持一致。3 种鱿鱼肌原纤维蛋白起泡性和泡沫稳定性下降的原因可能是随冻藏时间延长，鱿鱼肌原纤维蛋白含量下降及变性程度不断加剧，造成蛋白质分子间的范德华力及分子中氨基与羧基之间形成氢键的能力减弱[23]。冻藏120 d后，阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白起泡性较初始分别下降了50.00%、60.00%和58.82%，泡沫稳定性较初始分别下降5.88%、8.89%和5.31%。经冻藏后北太鱿鱼肌原纤维蛋白起泡性及泡沫稳定性明显低于阿根廷鱿鱼和秘鲁鱿鱼。这与董士远等[24]报道的结果相一致。

图6 3 种鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白起泡性（A）及泡沫稳定性（B）变化情况Fig.6 Changes in foaming activity (A) and foam stability (B) of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

2.7 鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白总巯基含量的变化

图7 3 种鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白总巯基含量变化情况Fig.7 Changes in total sulfhydryl contents of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

巯基具有较强的亲核性和还原性，对维护肌原纤维蛋白空间结构稳定、保持理化和功能性质具有重要意义。由图7可见，在冻藏15～30 d时，3 种鱿鱼肌原纤维蛋白总巯基含量均急速下降，而冻藏30 d后下降速度趋于平缓；在冻藏过程中，3 种鱿鱼肌原纤维蛋白总巯基含量变化趋势较为相似，三者之间并无明显差异。3 种鱿鱼肌原纤维蛋白总巯基含量不断下降，可能是因为肌原纤维蛋白冷冻变性逐渐加剧，加上冰晶颗粒产生的机械损伤作用破坏了肌原纤维蛋白空间结构，使得内部巯基暴露出来，进而被氧化形成二硫键[25-26]。冻藏120 d后，阿根廷鱿鱼肌原纤维蛋白总巯基含量较初始下降了76.66%，下降速率高于其他两种鱿鱼，这可能是因为阿根廷鱿鱼肌原纤维蛋白中有较多活性巯基（—SH1和—SH2）暴露出来，导致Ca2+-ATPase活性下降，进而造成了总巯基含量的下降。Chantarasuwan[27]和Kittiphattanabawon[28]等研究也指出，冻藏肌肉蛋白质中总巯基含量的下降往往也伴随着Ca2+-ATPase活性的不断下降，表明总巯基含量的下降与Ca2+-ATPase活性之间具有一定的相关性。

2.8 鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白羰基含量的变化

图8 3 种鱿鱼冻藏过程中肌原纤维蛋白羰基含量变化情况Fig.8 Changes in carbonyl contents of myofibrillar proteins in three squid species during frozen storage

蛋白质易被自由基氧化修饰而产生羰基化合物，肌肉中羰基含量一般可作为判断蛋白质氧化程度的重要指标[29]。如图8所示，冻藏0～15 d时，阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白羰基含量表现出相似的增加趋势，且三者之间无明显差异。冻藏120 d后，阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白羰基含量较初始分别增加了8.74、13.95 nmol/mg和4.79 nmol/mg，这可能是因为在冻藏过程中活性氧自由基攻击蛋白质氨基酸分子中的自由氨基或亚氨基，经一系列反应后生成氨基及相应的羰基衍生物；同时，活性氧自由基也能导致蛋白质肽链断裂，即在断裂地方也可产生羰基基团，致使肌肉中羰基含量不断增加[30-32]。冻藏0～120 d，北太鱿鱼羰基含量由1.57 nmol/mg增加至15.52 nmol/mg，增加速率明显高于其他两种鱿鱼，这可能是由于北太鱿鱼肌肉中含有较多的促氧化成分（如自由基等），导致北太鱿鱼蛋白质氧化迅速，致使羰基含量明显增加。而阿根廷鱿鱼和秘鲁鱿鱼羰基含量在整个冻藏期间变化趋势较为相似，并无明显差异。

3 结 论

以阿根廷鱿鱼、北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼肌原纤维蛋白为对象，研究冻藏对3 种鱿鱼肌原纤维蛋白功能特性的影响情况。结果表明，随着冻藏时间延长，3 种鱿鱼肌原纤维蛋白功能特性不断降低，同时其冷冻氧化程度均不断增加。其中，阿根廷鱿鱼肌原纤维蛋白质量浓度、Ca2+-ATPase活力、溶解性和总巯基含量下降速度明显低于北太鱿鱼和秘鲁鱿鱼，且浊度增加程度明显高于其他两组鱿鱼；北太鱿鱼肌原纤维蛋白起泡性、泡沫稳定性、乳化性、乳化稳定性下降速度及羰基含量增加量则高于阿根廷鱿鱼和秘鲁鱿鱼。综上，3 种鱿鱼在低温冻藏过程中，肌原纤维蛋白理化特性表现出相同的变化趋势，但不同理化特性下降幅度及速率有所不同。