感染性疾病mRNA疫苗的研究进展*

李 珍， 郑 芳， 程范军△

华中科技大学同济医学院附属协和医院 1血液科 2儿科，武汉 430022

近年来，核酸疫苗的研发已经成为疫苗研究领域的热点之一。核酸疫苗分为DNA疫苗和RNA疫苗两种。与灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗、肽类疫苗以及DNA疫苗相比，mRNA疫苗具有以下优点。第一，安全：mRNA不存在感染或插入突变的潜在风险，可通过正常细胞途径被降解，其体内半衰期可通过使用各种修饰和传递方法来调节，各种修饰和传递方法还可增加mRNA疫苗的稳定性而降低其负性免疫应答(如抑制抗原的表达)[1-2]。第二，高效：各种修饰提高了mRNA的稳定性和翻译效率，通过载体分子实现高效的体内传递。mRNA避免了预先存在或疫苗诱导的抗载体免疫，因此可以反复使用。第三，高产能：mRNA疫苗具有快速、廉价和可大量生产的潜力，是应对突发急性传染病的重要策略之一[1，3]。随着mRNA合成技术、分子修饰技术、递送技术的迅速发展，mRNA疫苗在感染性疾病、过敏性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤疾病的防治中取得了巨大进展[4]。本综述将概述mRNA疫苗在感染性疾病中应用的研究进展及其面临的挑战。

1 mRNA疫苗概述

mRNA疫苗是将在体外合成的编码特定抗原的mRNA序列递送至体内并表达相应的抗原蛋白，通过诱导针对该抗原蛋白的免疫应答反应从而达到预防和治疗疾病的目的[1]。mRNA疫苗目前主要有两种形式：非复制型mRNA疫苗(non-replicating mRNA，NRM)和自我扩增型mRNA疫苗(self-amplifying mRNA，SAM)，它们都是由正链RNA病毒衍生而来的。这两种形式的疫苗均包括5个元件：5′帽子结构(Cap)、5′和3′非编码区(UTR)、开放阅读框(ORF)和3′Poly(A)尾[5]。NRM由编码抗原和两侧的5′UTR和3′UTR构成；SAM不仅能编码抗原，还有类似病毒复制过程的序列，使其可以在细胞内复制以提高抗原蛋白表达量。NRM疫苗具有结构简单、RNA序列较短及无额外的编码蛋白，不会引起无关免疫反应的优势。与NRM疫苗相比，SAM疫苗接种会产生更高的抗原表达水平，且mRNA疫苗的有效接种剂量要低得多[6-7]。mRNA疫苗是通过体外转录技术生产的，以DNA为模板(如线性化质粒或PCR产物)，在T7，T3或Sp6噬菌体RNA聚合酶存在的条件下体外转录合成，最后加上5′Cap和3′Poly(A)尾，这一过程无需依赖细胞扩增，因此可快速大量生产[8]。

2 mRNA疫苗的制备

mRNA疫苗的制备主要涉及抗原的选择、mRNA疫苗的优化、递送系统的研发、疫苗免疫效果评价及其有效性和安全性评估等方面。mRNA可发挥疫苗的作用在20世纪90年代就已被发现，但随后的发展并不顺利，因为RNA必须避开RNase介导的降解和清除到达靶组织；当RNA遇到靶细胞时，必须通过细胞膜转运进入细胞质，从而启动宿主翻译机制和非结构蛋白的翻译。因此如何提高mRNA的稳定性和翻译效率，以及研发优良的递送载体是目前mRNA疫苗制备面临的主要问题[9]。

目前已有许多mRNA优化技术用来提高翻译效率和稳定性，比如优化5′UTR区和3′UTR区的调控元件来稳定mRNA并增加蛋白质翻译；使用修饰的核苷酸来减少先天免疫激活并提高翻译效率；合成帽类似物和帽酶以及通过与真核翻译起始因子4E(EIF4E)结合来增加蛋白质翻译从而稳定mRNA；通过分离和(或)净化技术来纯化mRNA，从而减少杂质的产生以免引起非特异性免疫；对序列和(或)密码子的优化来增加翻译等等[1，10]。虽然以上方式能积极调控蛋白表达，但这些形式的优化可能会影响mRNA的二级结构，导致其与人体自然转录的mRNA结构不一致，从而在蛋白质翻译和激活免疫反应的过程中存在差异[1]。

优良的递送载体对mRNA疫苗的有效性同样重要。理想情况下，递送载体应该保护RNA免受核糖核酸酶的潜在消化，并提供有效的靶细胞摄取，容易将RNA从载体上解离出来，并从内体中逃逸，并且载体应做到缺乏毒性和免疫刺激[4]。目前为止已有2种基本的方法来递送mRNA：第一，将mRNA加载到体外的树突状细胞(DCs)中再注入患者体内；第二，直接注射有或没有载体的mRNA[1，11]。根据递送载体的性质不同又分为病毒递送的mRNA疫苗和非病毒递送的mRNA疫苗两大类，其中非病毒递送包括裸mRNA直接注射、电穿孔、基因枪、鱼精蛋白、阳离子脂质体、脂质纳米粒子(LNP)、阳离子纳米乳液(CNE)、聚合物纳米粒等，其中LNP递送载体是近年来研究的热点[12]。

3 mRNA疫苗诱导免疫应答的机制

接种mRNA疫苗后，mRNA首先被内吞进入细胞，进入细胞的mRNA目前主要由2类模式识别受体(PRRs)来识别，一类是Toll样受体(TLRs)，包括TLR3、TLR7、TLR8和TLR9，主要定位于树突状细胞、巨噬细胞和单核细胞等细胞的内体中；另一类是定位于细胞质中的其他PRRs家族，包括RIG-I样受体家族(RLRs，包括RIG-I、MDA5和LGP2)、核苷酸寡聚结构域样受体(NLRs)、寡腺苷酸合成酶受体(OAS)和RNA依赖性蛋白激酶(PKR)[13]。这些不同途径的级联信号通路的激活可导致Ⅰ型干扰素(IFN)、肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素-6(IL-6)、IL-12、趋化因子(如CXCLs和CCLs)等的分泌，并在注射部位聚集，为诱导免疫反应创造了一个促炎的微环境[14]。如趋化因子可招募固有免疫细胞如DCs和巨噬细胞至接种部位从而诱导免疫应答；促炎细胞因子如TNF-α不仅诱导免疫反应而且有利于DCs向引流淋巴结(dLNs)的迁移从而诱导适应性免疫，已有体内实验证实在接种部位和引流淋巴结中均能检测到mRNA和编码的抗原[15]。mRNA可从内体逃逸至细胞质中并利用宿主细胞的蛋白质合成机制翻译成蛋白质，这些蛋白质产物可被降解为抗原肽并通过MHC Ⅰ类分子途径提呈给CD8+T细胞从而诱导免疫应答；也可被分泌至胞外经抗原提呈细胞(APCs)摄取，通过MHC Ⅱ类分子途径将抗原提呈给CD4+T细胞诱导免疫应答；还可通过抗原交叉提呈途径参与免疫应答[16]。

另一方面，在mRNA疫苗诱导免疫反应中，Ⅰ 型IFN能促进抗原致敏的CD8+T细胞向CD8+细胞毒T细胞分化也能诱导T细胞耗竭；Ⅰ 型IFN抑制或促进CD8+T细胞毒性效应可能与其持续分泌的时间、强度及受体有关[4，17]。此外，Ⅰ 型IFN可以诱导多种IFN刺激基因而抑制mRNA的翻译和促进mRNA的降解，从而抑制抗原的表达，对免疫应答产生消极作用[18]。因此，mRNA疫苗在体内诱导免疫应答是非常复杂的过程。此外，一些研究表明mRNA纯度和递送载体会影响mRNA疫苗刺激的免疫反应，如Karikó等[19]研究表明用伪核苷修饰的mRNA和用高效液相色谱(HPLC)纯化的mRNA可以降低免疫激活，增加抗原的稳定性和表达。Pardi等[20]研究表明LNP封装的经过修饰的mRNA疫苗具有佐剂效应且能诱导有效的细胞免疫反应。

4 mRNA疫苗在感染性疾病中的应用进展

mRNA疫苗在病毒、细菌和寄生虫等病原菌感染所致的疾病中均有应用，但主要应用于病毒感染性疾病且以RNA病毒感染为多见，感染性疾病mRNA疫苗的临床研究如表1所示。

表1 感染性疾病mRNA疫苗的临床研究*Table 1 Clinical research of mRNA vaccine for infectious diseases*

4.1 mRNA疫苗在病毒感染性疾病中的应用

4.1.1 RNA病毒感染性疾病 mRNA疫苗在RNA病毒感染性疾病中的研究聚焦于具有传染性强、危害性大的RNA病毒，如严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)、甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)、寨卡病毒(ZIKA)、人类免疫缺陷病毒(HIV-1)、埃博拉病毒(EBOV)和狂犬病毒等。

截止2020年11月22日，被列为国际关注的突发公共卫生事件的SARS-CoV-2感染确诊病例已超过5780万例，死亡病例增至130多万例[35]。目前为止，已有多种针对SARS-CoV-2的mRNA疫苗进入临床试验阶段(表1)。其中mRNA-1273疫苗由以LNP为载体的编码S蛋白的mRNA组成，该疫苗已完成Ⅰ期临床试验，在所有受试者中均诱导了免疫应答，且在100 μg剂量组中均诱导了持续高水平的中和抗体滴度，未报告疫苗相关的严重不良事件(SAEs)[21]。目前该疫苗已经进入Ⅲ期临床试验，旨在评估其安全性和能否有效预防新冠病毒感染，以及能够为人体提供多长时间保护[36]。BioNTech公司与复星医药及辉瑞联合研发的mRNA疫苗BNT162正在进行Ⅱ/Ⅲ期试验以评估其安全性和有效性[22-23]。目前国内首个新冠mRNA候选疫苗(ARCoV)已正式获批启动临床试验，此外全球还有许多SARS-CoV-2 mRNA疫苗的研究，但大多处于临床前期试验阶段[24，37]。

甲型流感对人类致病性高，曾多次引起世界性大流行。Magini等[38]首次发现以LNP为载体的编码基质蛋白1(M1)和内部核蛋白(NP)的SAM疫苗联合单价灭活流感疫苗(MIIV)可诱导特异性免疫应答，这种疫苗不仅靶向同源流感病毒还可在其他亚型流感病毒感染中产生保护性免疫反应。有动物实验表明，即使在单次应用编码各种流感病毒HA、NP和NA的mRNA疫苗(包含未经修饰、纯化的、抗原编码的和鱼精蛋白复合物的mRNA)也会诱发保护性免疫反应[39]。目前已有以LNP为载体的经化学修饰的编码H10N8或H7N9血凝素的mRNA疫苗进入Ⅰ期临床试验，研究结果显示疫苗能诱导强烈的免疫反应而发挥明显的预防保护作用，且未报告SAEs[27]。

RSV感染是5岁以内儿童病毒性肺炎的主要病原体，也是因严重下呼吸道感染住院的主要原因。Geall等[40]发现给小鼠和棉鼠肌注极低剂量的以LNP为载体的编码F蛋白的SAM疫苗，可诱导产生极高滴度的IgG抗体，且IgG2a抗体的滴度要高于IgG1抗体滴度；同时诱导明显的CD4+和CD8+T细胞反应。Brito等[41]研发了一种利用CNE为递送载体编码RSV F蛋白的mRNA疫苗，该疫苗免疫接种于小鼠后可在体内产生较高滴度的抗原特异性IgG抗体和RSV中和性抗体。

ZIKA感染主要在全球热带及亚热带地区流行，可通过母婴传播致使胎儿生长发育异常。ZIKA的E蛋白由3个外结构域(DⅠ、DⅡ和DⅢ)组成，是中和抗体的主要靶点，ZIKA与登革热病毒(DENV)的E蛋白具有54%至59%的氨基酸同源性，ZIKA mRNA疫苗诱导的免疫反应有可能增加患者对严重DENV感染的敏感风险。为了降低这种交叉反应，对编码寨卡病毒包膜蛋白prM-E的mRNA进行修饰，破坏E蛋白中保守的融合环表位即免疫显性交叉反应表位，最后再用LNP递送。这种经修饰的mRNA疫苗既诱导了小鼠对ZIKV的保护性抗体反应又减少了交叉反应抗体的产生[42]。目前已有针对ZIKV的mRNA疫苗进入临床试验，如mRNA-1325，此疫苗是由LNP递送的编码prM-E蛋白的并经过核酸修饰的mRNA疫苗，但尚未公布临床试验结果[29]。

埃博拉病毒病是一种烈性传染病，可引起严重的出血热，死亡率极高。Meyer等[43]研发了2种编码EBOV糖蛋白的mRNA疫苗：疫苗A(编码全长EBOV糖蛋白的疫苗)和疫苗B(将糖蛋白的真实信号肽与来自人类Igκ的信号肽替换)。2种疫苗均以LNP为载体肌注至豚鼠体内，结果表明2种疫苗接种后均能产生EBOV糖蛋白特异性的IgG抗体以及EBOV中和抗体，但疫苗B产生的抗体滴度均高于疫苗A；研究还表明对已感染EBOV的豚鼠进行疫苗接种后，豚鼠的存活率为100%[43]。

艾滋病是危害性极大的传染病，HIV能攻击人体的免疫系统从而出现各种严重并发症。Ganghi等[32]将编码HIV-1的Gag或Nef基因且含有溶酶体靶向序列的mRNA转染到DCs中后接种于人体，可在体内观察到抗原特异性免疫反应，但免疫反应与安慰剂组没有差异。Jacobson等[30]研发的AGS-004疫苗是将来源于患者自身HIV-1的Gag、Nef、Rev和Vpr抗原编码至mRNA中，再转染到患者的DCs中，该疫苗在抗逆转录病毒治疗期间诱导了特异性免疫反应，但与安慰剂相比，使用AGS-004后未见抗病毒效果。Melo等[44]研发了一种经LNP递送的编码HIV胚系靶向抗原eOD-GT8的mRNA疫苗，该疫苗在小鼠中能诱导特异性的免疫反应以抵御HIV的感染。

狂犬病属于致命性的急性传染病。CV7201是由编码狂犬病病毒糖蛋白(RABV-G)的mRNA与阳离子蛋白鱼精蛋白以游离和络合的形式组成的一种冻干、温度稳定的mRNA疫苗，皮内或肌肉注射此疫苗于动物体内可诱导特异性、长期和保护性的B细胞和T细胞反应[45]，且Ⅰ期临床试验结果表明无论给药方式还是给药途径都是安全的，但仅在使用无针装置皮下或肌肉注射时具有免疫原性[34]。这些证据提示：CV7201作为预防狂犬病的mRNA疫苗有着良好前景。目前由同一公司研发的CV7202疫苗，即经LNP递送的编码狂犬病病毒糖蛋白的mRNA疫苗已启动Ⅰ期临床试验[7]。

4.1.2 DNA病毒感染性疾病 巨细胞病毒(CMV)和人乳头状瘤病毒(HPV)都属于DNA病毒。CMV感染是一种常见感染，可垂直传播给胎儿，是引起新生儿先天缺陷和智力发育不全最主要的病原体之一。一项临床试验研究表明：接种负载编码人巨细胞病毒pp65蛋白mRNA的DCs疫苗后，2/3的受试者能诱导或扩大CMV特异性细胞免疫反应[46]。John等[47]研发了一种LNP递送的编码有HCMV糖蛋白B和5种不同亚基(gH、gL、UL128、UL130和UL131A)组成的五聚体复合物的mRNA疫苗，在小鼠和非人灵长类动物中产生了有效和持久的中和抗体。目前已有核酸修饰的LNP封装的mRNA疫苗(mRNA-1647)进入了临床试验[7]。HPV16感染与多种癌症有关，其转化活性主要取决于病毒癌蛋白E6和E7的表达，Grunwitz等[48]研发了一种可经静脉给药的脂质体递送的编码有E6和E7基因的mRNA疫苗，用此疫苗免疫小鼠可诱导强烈的特异性免疫反应。

4.2 mRNA疫苗在细菌感染性疾病中的应用

在细菌感染性疾病中，针对链球菌和结核杆菌感染的疫苗研究较多。SLOdm抗原和BP-2a抗原分别在A族链球菌(GAS)和B族链球菌(GBS)的致病中起着关键作用。Maruggi等[49]在动物实验中发现：接种CNE递送编码SLOdm或BP-2a抗原的SAM疫苗后都能产生特异性免疫反应。65 kD热休克蛋白(HSP65)是结核分枝杆菌(MTB)感染过程中的主要免疫反应蛋白之一。Lorenzi等[50]研发了一种经鼻内给药的编码HSP65蛋白的mRNA疫苗，研究表明小鼠接种该疫苗后可免受结核分枝杆菌毒力菌株的感染，且这种鼻内给药途径可减轻小鼠肺部细菌负荷和炎症。

4.3 mRNA疫苗在寄生虫感染性疾病中的应用

mRNA疫苗在寄生虫感染中应用较少。Chahal等[51]利用树状大分子纳米粒子(MDNP)递送编码GRA6、ROP2A、ROP18、SAG1、SAG2A和AMA1等6种特异性抗原的SAM疫苗接种小鼠，能保护其免受致死性弓形虫的感染。Duthie等[52]发现用编码杜氏利士曼原虫LEISH-F2基因的SAM疫苗与一种亚单位疫苗联用后，可显著减轻肝脏寄生虫负担。Baeza等[53]发现利用编码疟原虫巨噬细胞迁移抑制因子(PMIF)的SAM疫苗可以产生PMIF特异性免疫反应，从而获得抗疟疾感染的保护性免疫，此疫苗还可以增强对疟原虫的控制，防止再次感染。

5 mRNA疫苗的发展前景

mRNA疫苗无需进入细胞核，没有整合基因组的风险，生产合成高效快速、成本低，可同时激活MCHⅠ和MCHⅡ途径从而诱导CD4+和CD8+T细胞免疫应答，且自身具有免疫佐剂作用，使其有望成为预防感染性疾病大流行的有力工具。尽管mRNA疫苗有着巨大的应用前景，mRNA疫苗的发展也存在一些风险，如mRNA疫苗在动物模型和人体内应用的安全性和有效性数据存在较大差异，此外mRNA疫苗还可能引起一些副作用如局部和全身炎症，还有非原生核苷酸及载体引入的成分所具有的潜在毒性等。因此还需充分研发mRNA疫苗以提高其稳定性和抗原在体内的表达，从而提高疫苗的疗效；还需研发更优良的递送工具；mRNA疫苗诱导免疫反应的机制仍有待进一步阐明；还需要探索新的策略来开发更有效的mRNA疫苗疗法，包括了解最佳给药途径和优化疫苗接种剂量及次数，并且不断拓展其在各种疾病中的应用。