Alagille综合征临床病理及基因突变特征分析1例*

李 红， 周俪姗， 王 芳， 汤建桥， 鄢素琪

华中科技大学同济医学院附属武汉儿童医院(武汉市妇幼保健院)中西医结合科，武汉 430016

Alagille综合征(Alagille syndrome，ALGS)是一种罕见的常染色体显性遗传病，其病变可累及肝脏、心脏、骨骼、眼睛、颜面及肾脏等多器官，最早在1969年由Alagille及其同事报道，并在1975年由Alagille[1]再次报道并确定了诊断标准。近年来分子遗传学研究证实，ALGS与Notch信号传导通路中JAG1基因和NOTCH2基因突变有关，其中94%～96%患者存在JAG1基因(20p12)突变，2%～3%患者与NOTCH2基因(1p12)突变有关[2]。其中符合经典临床特征，由编码Jagged1的JAGl基因(OMIM：601920)突变或缺失所引起的，称之为ALGS1型；与经典临床特征不完全符合，肾脏病变及胆管稀疏多见，骨骼畸形及特征性面容相对少见，由NOTCH2基因(OMIM：600275)突变导致的，称之为ALGS2型[3]。国外该病的发病率约为1/30000[2]，但我国目前尚无相关统计数据。该病临床表现变异性高，发病率低，临床确诊难度大，近年来分子诊断技术的开展提高了本病的确诊率。本文报道1例JAG1基因突变ALGS患儿的临床病理特征及分子诊断结果，为本病诊断提供参考。

1 临床资料

患儿，男，2月12 d。因“发现皮肤巩膜黄染2月余”入院。患儿为第1胎第1产，出生体重2.65 kg，足月自然产，否认窒息抢救史。患儿出生时全身皮肤及巩膜黄染，并逐渐加重，大便浅黄色，7～8次/d，偶有陶土色大便，小便色黄，母乳喂养，否认呛奶，无发热，无咳嗽，无抽搐。曾于当地医院予护肝利胆治疗，患儿无明显好转。经会诊后在外科全麻下行腹腔镜下胆道造影术。术中可见肝内外胆管显影，术中诊断“胆汁淤积性肝炎”，予胆道冲洗，术后行抗感染(头孢他啶)、抗病毒(更昔洛韦)、护肝(阿拓莫兰、肌苷、门冬氨酸鸟氨酸、思美泰)、利胆(熊去氧胆酸及中药复方煎剂口服)对症治疗20 d，患儿黄疸稍有消退出院。1周后患儿因黄疸加重入住我院。查体：体重4.1 kg(<-2SD)，身长55 cm(<-2SD)。神志清楚，宽额头，小下颌(图1)，皮肤、巩膜重度黄染。心律齐，心音有力，各瓣膜区未闻及杂音。双肺呼吸音粗，未闻及干湿啰音及胸膜摩擦音。肝脏肋下2.5 cm，质中，脾脏肋下1.0 cm，质软。双下肢无水肿。辅助检查，血检常规：白细胞计数(WBC)9.46×109/L，血红蛋白(HGB)100 g/L，血小板(PLT)462×109/L，淋巴细胞百分比(LYM%)71.7%，中性粒细胞百分比(NEU%)18.9%，细胞形态未见异常。大便常规：正常。尿液分析：尿胆红素(BIL)3+。血巨细胞病毒(CMV)抗体：CMV-IgM阳性，CMV-IgG阳性。血、尿CMV-DNA均阴性。EB病毒抗体：EB-IgG阳性，EBNA-IgG阳性。细小病毒B19、乙肝、丙肝、梅毒、HIV病毒抗体均为阴性。甲状腺素(T4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、促甲状腺激素(TSH)均正常。血铜蓝蛋白测定正常。降钙素原(PCT)0.190 ng/mL，超敏C反应蛋白(CRP)正常。免疫全套：IgG 4.41 g/L。多次肝功能及胆汁酸等指标显著异常(表1)。肾功能、心肌酶谱、电解质、血糖、血氨均正常。乳酸(LAC)4.30 mmol/L。血脂：总胆固醇(CHOL)6.50 mmol/L，甘油三酯(TG)2.34 mmol/L，高密度脂蛋白(HDL)0.13 mmol/L，低密度脂蛋白(LDL)3.39 mmol/L。凝血象：纤维蛋白原(FIB)1.96 g/L。血、尿串联质谱未见明显异常。心电图：不完全性右束支传导阻滞。心脏彩超未见明显异常。肝脾胆囊彩超：肝脏及脾脏未见明显异常，胆囊充盈欠佳。胸部X线片(图2)示T7椎骨呈蝶形畸形。上腹部磁共振(MR)平扫+磁共振胆胰管造影(MRCP)检查未见胆囊显示。SPECT肝胆动态显像示肝脏摄取功能差，清除功能减低，胆道系统排泄明显受阻。肝组织活检(图3)符合胆汁淤积性肝脏病变表现。经医院医学伦理委员会批准及患儿家长知情同意，分别取患儿及其父母外周静脉血2 mL，EDTA抗凝，采用QIAamp DNA Blood Mini Kit(Qiagen公司，德国)从全血中提取DNA，通过Qubit及琼脂糖凝胶电泳测定提取的DNA样本含量及质量。应用Roche SeqCap EZ MedExome Kit以全外显子组测序方法进行目标区域捕获，使用illumina Hiseq X-ten二代测序仪对富集的文库进行PE150测序，平均测序深度为100X，95%以上的区域达到20X以上的覆盖度。测序后得到FASTQ格式的原始数据，再经过以下处理：①通过BWA软件(v0.7.12-r1039)将短reads和参考基因组(hg19)进行对比，确定短序列在基因组上的位置；②使用SAMtools软件(v0.1.18)对这些短序列进行排序，并进行数据格式的转换；③使用Picard软件(v1.134)去除测序过程中产生的冗余信息和噪声；④使用GenomeAnalysisTK(GATK v3.7)软件寻找样本测序数据与参考基因组差异的位点(包括SNV和InDel)；⑤使用ANNOVAR软件(2016 Jul16 version)对这些变异位点进行功能注释，并使用ExAC、1000 Genomes Project和ESP6500等普通人公共数据库过滤突变。测序峰图用Chromas2软件观察。根据二代测序检测结果对患儿及其父母进行Sanger测序验证排除假阳性。以上测序由杭州奕真生物科技公司完成，测序引物，正向：5′-CGCCTAGTTTCAAGCCAAAG-3′，反向5′- GA-GGGAGTCGCCACCTCTAT-3′，退火温度60℃，产物长度491 bp。全外显子组测序(图4)检出1个与表型相关的杂合型JAG1c.184G>T(p.G62X)无义突变，该变异为终止变异，导致第62位氨基酸之后编码提前终止。家系验证结果显示该杂合突变遗传自父亲。变异JAG1c.184G>T(p.G62X)导致编码的蛋白质翻译提前终止，理论上严重危害蛋白质功能，根据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)序列变异解读标准和指南进行致病性评级，该变异致病性评级符合PVS1 +PM2，为疑似致病性变异。

患儿临床表现为黄疸，特殊面容(图1)，蝶形椎骨(图2)，实验室检查提示ALT、AST、ALP、γ-GT、TBA等均明显异常(表1)，CHOL、TG升高。肝组织活检符合胆汁淤积性肝脏表现(图3)。全外显子组测序(图4)提示JAG1c.184G>T(p.G62X)无义突变。患儿诊断ALGS。

图1 Alagille综合征患儿特殊面容Fig.1 Typical facial features of this case

箭头所示T7椎骨呈蝶形畸形

镜下见肝小叶结构尚存，肝细胞变性，肝细胞及胆小管内胆汁淤积，汇管区纤维组织增生及炎性细胞浸润。

A、B、C分别表示患儿、其母亲、其父亲的测序峰图；箭头所示为杂合套峰

表1 随年龄变化动态观察实验室指标Table 1 Changes of laboratory indexes with age

2 讨论

2.1 临床特征分析

①ALGS确诊费时长。患儿因“黄疸”这一突出临床表现多次就诊，并因此反复住院3次，经历有创的腹腔镜胆道造影检查，最终经全外显子组测序检查明确诊断。由此可见临床上要将ALGS与其它病因导致的胆汁淤积性肝病相鉴别，存在相当程度的困难。②ALGS面部特征直观，诊断价值较高。慢性淤胆、特征性面容、心血管异常、蝶形椎骨、角膜后胚胎环是ALGS的5大典型临床特征，其病变虽然涉及多个系统，但有些患者脊柱、眼睛、肾脏异常的临床表现并不显著。本例患儿有脸小额宽且前额突出、眼窝深陷眼距宽、下颌尖向前突出的典型“倒三角型”面容(图1)，面部特征直观，提示临床体检时应引起高度关注。③ ALGS表型变异性高，个体表现度差别大。虽有文献报道[4]ALGS的显性率达98%左右，但由于各种复杂因素的影响，常染色体显性遗传的杂合子可能表现为不规则显性或者不完全显性，也可表现为不同的表现度和不外显[5]，导致不同个体间临床表现差异很大。多项研究报道，即使同一家庭携带同一种变异的不同个体之间，其表现也可能各异，轻者症状轻微甚至无症状，重者则具有典型的临床表现及严重的并发症，需要肝移植[6]。甚至在遗传背景完全相同的个体之间，其临床表现也可能不一致。据报道，一对均因JAG1突变致病的同卵双生双胞胎，其中一个出现严重的肺动脉闭锁和轻微肝损伤，另一个则出现严重的肝脏病变而需肝脏移植[7]。④ALGS具有不外显现象。据报道，2例ALGS患儿的变异均来自于母亲，但其母亲无任何相应临床表现[8]。本例患儿的变异来自于父亲，其父亲也无相关临床表现。ALGS患者临床表现与其基因突变的相关性目前还不清楚，推测可能一些遗传修饰基因发挥了作用[9]。

2.2 ALGS病理诊断及拓展

ALGS经典诊断标准为肝组织活检病理证实存在肝内小叶间胆管数量减少或缺如，并具备3个主要临床表现。但随着研究的不断深入，发现部分ALGS患者其小叶间胆管的异常是在生后逐渐发生的，在婴儿早期并无小叶间胆管减少或消失，在出生后的前3个月ALGS肝内胆管稀疏症的病理改变并不显著[10]，甚至有病例因以肝内胆管增生扩张为主要病理表现而被误诊为胆道闭锁[11]。该发现动摇了“ALGS患者肝组织活检存在小叶间胆管减少或缺乏”这个一度被认为是最重要且恒定特征的观点。还有研究报道6月龄前行肝组织活检，病理发现有小叶间胆管缺乏的约占60%；而6月龄后进行肝组织活检，这一比例可上升至95%[12]。对于3岁以下的ALGS患者，有研究认为其肝组织活检病理常以肝巨大细胞、胆管异常增生、肝内胆汁淤积为主[13]，而非特征性的肝内胆管稀少。本例肝组织活检也以肝脏胆汁淤积的病理表现为主，未发现典型的小叶间胆管减少缺乏(图3)。此外，还有研究报道[14]，ALGS可能不是唯一具有小叶间胆管缺乏的综合征(尤其是小于胎龄的新生儿)，HNF1β缺陷也应考虑排除。因此结合患儿年龄段，选择合适时机完善肝组织活检，并动态追踪，综合分析肝组织活检结果，可以一定程度上避免漏诊误诊ALGS。

2.3 基因突变分析

随着对ALGS认识的不断积累，近年对ALGS的诊断标准进行了修订[15]，其内容为：如果肝组织活检不表现为肝内小叶间胆管数量减少或缺如，或未行肝组织活检者，符合4个或以上主要表现也可诊断；如果已知有JAG1基因突变或家族阳性史时，具备1个或以上主要表现也可确诊ALGS。该标准使ALGS的诊断从临床诊断、病理诊断阶段过渡到结合分子诊断的阶段。JAGl基因定位于染色体20p12，共有26个外显子，全长36 kb。JAGl蛋白含1218个氨基酸，由胞内段、跨膜段及膜外区域组成，作为配体参与Notch信号通路[16]。自首次被分子诊断以来，目前已发现500多种JAG1基因突变，包括错义突变、无义突变、插入、缺失、剪接位点突变等多种突变类型。国内的一项研究报道在76.9%患者中检测到JAG1致病突变[17]。本例患儿JAG1基因2号外显子存在杂合突变c.184G>T(p.G62X)，使184位核苷酸鸟嘌呤(G)被胸腺嘧啶(T)所取代，为终止变异，导致第62位甘氨酸之后编码的蛋白质翻译提前终止，可能对蛋白质的结构或功能产生影响。查阅外显子组整合数据库(ExAC，http：//exac.broadinstitute.org)、千人基因组计划(http：//browser.1000 genomes.org)、基因组聚合数据库(gnomAD，http：//gnomad-old.broadinstitute.org)，目前均未收录该变异信息。ClinVar数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)和人类基因突变数据库(HGMD，http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)中目前也均未有该变异的报道。目前ALGS以支持治疗为主，无根治手段。肝移植的适应证包括严重的瘙痒、合成功能障碍、门静脉高压、反复骨折和严重生长发育迟缓[2]。随访得知，本例患儿后行2次肝移植，现黄疸消退，病情稳定，其远期预后有待进一步观察。

ALGS的低发病率及宽泛的临床表现，肝组织活检病理变化的时限性，使得临床医生在诊断该病时面临巨大挑战，早期对胆汁淤积性肝病患儿开展Notch信号通路JAG1致病基因筛查，有助于ALGS的诊断。