miR-95-5p靶向BMP2调控脂肪干细胞成骨分化的作用及机制*

孟祥伟， 郑 峰

1青海大学研究生院，西宁 8100162 青海省人民医院骨科，西宁 810007

组织工程技术是近年来兴起的骨缺损修复手段，干细胞是组织工程技术中重要的种子细胞，具有自我更新和多向分化的潜能，在特定条件下能够向成骨细胞分化并对骨缺损进行修复[1-2]。脂肪干细胞(adipose derived mesenchymal stem cells，ADSCs)是组织工程领域常用的间充质干细胞，从脂肪组织分离得到，具有来源广泛、生物相容性良好等优势，能够向成骨细胞分化，但调控ADSCs成骨分化的机制尚不十分清楚，这也限制了ADSCs在骨缺损修复中的应用价值。

微小RNA(microRNA，miR)是近年受到越来越多关注的一类非编码小分子RNA，在转录后水平调控基因表达，进而在细胞增殖、凋亡、分化等多个生物学环节中发挥调控作用。多项组织工程相关的研究证实，miRs对ADSCs、骨髓间充质干细胞等的成骨分化、成脂分化具有调控作用[3-5]。另有一项关节软骨的相关研究表明，miR-95-5p对间充质干细胞的软骨分化具有调节作用[6]，但miR-95-5p在干细胞成骨分化中的作用未见报道。经前期生物信息学分析，miR-95-5p对成骨过程中的关键调控基因骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)具有靶向调控作用。在此基础上，本实验以ADSCs为对象，具体分析了miR-95-5p靶向BMP2调控ADSCs成骨分化的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物 雄性C57BL/6小鼠购自上海杰思捷实验动物有限公司，体质量18～25 g，生产许可证号SCXK(沪)2018-0004。

1.1.2 试剂 Ⅰ型胶原酶、胰蛋白酶购自Gibco公司；阴性对照(negative control，NC)mimic，miR-95-5p mimic购自上海吉玛公司；转染试剂Lipofectamine2000、流式细胞术试剂盒及CD44、CD90、CD105、CD45抗体购自Thermo公司；地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C、茜素红购自Sigma公司；碱性磷酸酶(ALP)检测试剂盒购自北京索莱宝公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒，BMP2、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx2)、骨钙素(osteocalcin，OCN)一抗购自Abcam公司；BMP2基因荧光素酶报告基因及检测试剂盒购自Promega公司。

1.1.3 仪器 细胞培养箱、流式细胞仪为Thermo公司产品，多功能酶标仪为北京普朗新技术公司产品，凝胶成像仪为上海金鹏分析仪器公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 ADSCs的分离培养 C57BL/6小鼠处死并取腹股沟脂肪组织，剪碎后加入0.2%Ⅰ型胶原酶，消化50 min，1000 r/min离心8 min后收集沉淀，磷酸盐缓冲液清洗并离心，用含有10%胎牛血清的完全培养液重悬，接种在培养瓶内，每2～3天换液1次。待细胞铺满培养瓶底层80%～90%后，用0.25%胰蛋白酶消化并传代继续培养。取第3代PDLSCs进行鉴定，4℃避光孵育CD44、CD90、CD105、CD45抗体1 h后，在流式细胞仪上检测上述抗体的表达情况。

1.2.2 ADSCs的分组及转染 取第3代ADSCs进行分组。miR-NC组转染NC mimic，miR-95-5p转染miR-95-5p mimic，转染均采用Lipofectamine2000进行，按照试剂盒说明书进行转染操作。每组设5个复孔。

1.2.3 成骨诱导分化 配置成骨诱导培养液，即含有0.1 μmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠、50 mg/L维生素C、10%胎牛血清的培养液(α-MEM)。ADSCs分组转染后24 h，将转染培养液更换为成骨诱导培养液，进行成骨诱导分化。诱导分化过程中，每2天更换1次成骨诱导培养液。诱导分化后第3、5、7天时，收集细胞并进行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)及Western blot检测；诱导分化第14天时，收集细胞进行茜素红染色。

1.2.4 ALP活力及ALP染色的检测 收集ADSCs，用ALP检测试剂盒测定细胞中ALP的活力，用BCA试剂盒测定细胞中的总蛋白含量，而后计算每毫克蛋白对应的ALP活力。另外采用多聚甲醛室温固定20 min，弃多聚甲醛后，每孔加入大约200 μL染液进行ALP染色，避光30 min，观察染色结果。

1.2.5 钙结节的茜素红染色 用75%乙醇固定ADSCs 30 min，磷酸盐缓冲液漂洗3次后用0.1%茜素红在37℃染色30 min，在显微镜下观察染色情况；加入10%氯化十六烷基吡啶500 μL，充分溶解钙结节，混匀后取50 μL液体加入96孔培养板内，在酶标仪上检测570 nm波长的吸光度(A570nm)。

1.2.6 miR-95-5p表达的检测 ADSCs按1.2.2项的方法分组转染后24 h进行miR-95-5p表达的检测，首先，按照miR提取试剂盒的说明书进行操作，提取组织中的miR；而后按照miR cDNA第一链合成试剂盒的说明书进行操作，将组织中的miRNA反转录为cDNA；最后，按照miR荧光定量PCR检测试剂盒配置PCR反应体系，分别使用目的基因miR-95-5p及内参基因U6的引物进行PCR反应，反应程序为：95℃预变性3 min后95℃15 s及60℃34 s，重复40个循环。反应完成后，软件中自动生成反应的循环曲线及循环阈值(Ct)，以U6为内参，根据公式2-ΔΔCt计算miR-95-5p的表达量。

1.2.7 蛋白表达的检测 收集ADSCs，加入RIPA裂解液提取细胞中的蛋白，采用BCA试剂盒测定蛋白含量，取含有30 μg蛋白的样本进行Western blot检测，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶内进行电泳以分离蛋白，而后电转至PVDF膜，在5%脱脂牛奶中封闭PVDF膜1 h，在Runx2、OCN、BMP2、β-actin一抗中孵育过夜。次日，室温孵育二抗2 h，最后在凝胶成像仪中显影得到蛋白条带，用Image J软件扫描蛋白条带的灰度值，按照目的蛋白灰度值/β-actin灰度值计算Runx2、OCN、BMP2的蛋白相对表达水平。

1.2.8 双荧光素酶报告基因实验 将BMP2荧光素酶报告基因与NC mimic或miR-95-5p mimic共转染进入ADSCs，24 h后用双荧光素酶报告基因检测系统分别测定细胞中萤火虫荧光活力及海肾荧光活力，按照公式(萤火虫荧光活力/海肾荧光活力)计算双荧光素酶报告基因的荧光活力。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 ADSCs干细胞特征的鉴定

经流式细胞仪检测，ADSCs表面CD105、CD29、CD44的阳性表达率均在98%以上，CD45的阳性表达率低于1%，说明ADSCs符合间充质来源干细胞的特性。见图1。

图1 ADSCs表面CD105、CD29、CD44、CD45的阳性表达率Fig.1 The positive expression rates of CD105，CD29，CD44 and CD45 on the surface of ADSCs

2.2 miR-95-5p mimic的转染效率及ADSCs成骨诱导分化后miR-95-5p的表达

ADSCs成骨诱导分化前及分化过程中，与空白对照组比较，miR-NC组ADSCs中miR-95-5p的表达水平无明显差异(均P>0.05)；与miR-NC组比较，miR-95-5p组ADSCs中miR-95-5p表达水平明显增加，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 miR-95-5p mimic的转染效率及ADSCs成骨诱导分化后miR-95-5p的表达Table 1 Comparison of miR-95-5p expression before and after osteogenic differentiation of ADSCs among three groups

2.3 miR-95-5p对ADSCs成骨诱导分化后ALP活力及ALP染色的影响

与空白对照组比较，miR-NC组ADSCs成骨诱导分化后第3、5、7天时的ALP活力及ALP染色无明显差异(均P>0.05)；与miR-NC组比较，miR-95-5p组ADSCs成骨诱导分化后第3、5、7天时的ALP活力及ALP染色明显降低，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2和图2。

表2 各组ADSCs成骨诱导分化后ALP活力的比较Table 2 Comparison of ALP activity after osteogenic differentiation of ADSCs among three

图2 各组ADSCs成骨诱导分化后ALP染色比较(×100)Fig.2 Comparison of ALP staining after osteogenic differentiation of ADSCs among three groups(×100)

2.4 miR-95-5p对ADSCs成骨诱导分化的钙结节水平的影响

与空白对照组比较，miR-NC组ADSCs成骨诱导分化后第14天时钙结节形成无明显差异(均P>0.05)；与miR-NC组比较，miR-95-5p组ADSCs成骨诱导分化后第14天时的A570nm值明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3和图4。

图3 各组ADSCs成骨诱导分化后的茜素红染色图Fig.3 Comparison of alizarin red staining of ADSCs after osteogenic differentiation among three groups

与miR-NC组比较，*P<0.05

2.5 miR-95-5p对ADSCs中成骨标志基因Runx2、OCN蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，与空白对照组比较，miR-NC组ADSCs成骨诱导分化后第6天时细胞中Runx2、OCN的表达水平无明显差异(均P>0.05)；与miR-NC组比较，miR-95-5p组ADSCs成骨诱导分化后第6天时细胞中Runx2、OCN的表达明显降低，差异有统计学意义(均P<0.05)。见图5、表3。

图5 各组ADSCs成骨诱导分化后Runx2、OCN的蛋白条带Fig.5 Runx2 and OCN protein expression in ADSCs after osteogenic differentiation

表3 各组ADSCs成骨诱导分化后Runx2、OCN蛋白表达水平的比较Table 3 Comparison of Runx2，OCN expression levels after osteogenic differentiation of ADSCs in three

2.6 miR-95-5p对ADSCs中BMP2的靶向调节作用

经Targetscan数据库分析，BMP2基因mRNA 3′UTR中有miR-95-5p的结合位点，见图6；与miR-NC组比较，miR-95-5p组ADSCs成骨诱导分化后第6天时细胞中BMP2的表达水平明显降低(P<0.05)，见图7、表4；与miR-NC组比较，miR-95-5p组ADSCs中野生型BMP2荧光素酶报告基因的荧光活力明显降低(P<0.05)、突变型BMP2荧光素酶报告基因的荧光活力无明显变化(P>0.05)，见表4。

图6 BMP2基因mRNA 3′UTR中miR-95-5p的结合位点Fig.6 Binding site of miR-95-5p in BMP2

图7 各组ADSCs中BMP2的蛋白条带Fig.7 Protein bands of BMP2 in ADSCs of three groups

表4 各组ADSCs中BMP2表达水平及荧光素酶报告基因荧光活力的比较Table 4 Comparison of BMP2 expression level and luciferase reporter gene fluorescence activity in ADSCs among three

3 讨论

ADSCs是组织工程领域重要的种子细胞，不仅具有自我更新及多向分化的干细胞特性，还具有取材来源丰富、生物相容性良好的优点，其在骨缺损修复、组织缺血再灌注损伤中的应用价值受到了越来越多重视。骨缺损修复一直是骨科研究关注的热点，在骨缺损修复过程中，ADSCs通过向成骨细胞的分化来发挥治疗作用，是骨科治疗骨缺损的理想材料[7]。由于ADSCs的成骨分化受到多种理化因素的影响，如何调控ADSCs定向分化为成骨细胞成为影响ADSCs用于骨缺损修复治疗效果的重要因素。

miR是组织工程领域的热点分子，长度约18～25 bp，且不具备编码氨基酸的功能，其生物学功能是与靶基因mRNA 3′UTR结合并使基因表达沉默，进而实现对细胞增殖、凋亡、分化等的调控。骨科相关的研究表明，miR-95-5p能够促进间充质干细胞向软骨分化[6]；另有研究表明，miR-95-5p还能促进间充质干细胞的肌源性分化[8]。由此推断，miR-95-5p在干细胞向成体细胞分化的过程中发挥了一定的调控作用，但其在干细胞成骨分化过程中的作用尚不明确。本实验在分离ADSCs后，通过转染miR-95-5p mimic的方式增加了细胞中miR-95-5p的表达量，而后进行成骨诱导分化并发现：过表达miR-95-5p后成骨诱导分化的钙结节明显减少，表明miR-95-5p能够抑制ADSCs的成骨分化。

在干细胞成骨分化的过程中，ALP的活力不断增强并介导了骨质矿化的过程，因此ALP活力是评价成骨分化的重要指标之一[9]。本实验在过表达miR-95-5p并进行成骨诱导分化后，细胞中ALP的活力及染色明显降低，与茜素红染色观察到钙结节数目减少的结果吻合，进一步确认了miR-95-5p抑制ADSCs成骨分化的作用。Runx2和OCN是成骨细胞的标志基因，前者是促进成骨的转录因子，后者是成熟骨质中主要的非胶原成分[10-12]，本实验观察到：过表达miR-95-5p并进行成骨诱导分化后细胞中Runx2和OCN的表达水平明显降低，表明miR-95-5p能够抑制ADSCs中成骨标志基因的表达，进而验证了miR-95-5p抑制ADSCs成骨分化的作用。

在干细胞向成骨细胞或软骨细胞、肌细胞分化的过程中，miR-95-5p并不直接影响干细胞的分化，而是通过调控不同靶基因的表达来影响干细胞的分化。前期在Targetscan数据库中进行生物信息学分析发现，BMP2是miR-95-5p的潜在靶基因之一。BMP2是目前已知与成骨分化调控关系最密切的基因之一，已有研究表明，过表达BMP2能够促进干细胞的成骨分化[13-14]，而敲低BMP2能够抑制干细胞的成骨分化[15]。本实验在前期生物信息学分析的基础上，进一步分析了miR-95-5p对ADSCs中BMP2的调节作用并发现：过表达miR-95-5p并进行成骨诱导分化后细胞中BMP2的表达水平明显降低。在转染野生型BMP2的荧光素酶报告基因后，miR-95-5p能够降低荧光活力；而在根据生物信息学预测的结果对野生型荧光素酶报告基因进行突变后，miR-95-5p不再影响荧光活力。以上结果表明miR-95-5p能够靶向抑制ADSCs中BMP2的表达，且miR-95-5p的靶向位点与前期生物信息学预测一致，进而提示靶向抑制BMP2基因可能是miR-95-5p抑制ADSCs成骨分化的分子机制之一。

综上所述，miR-95-5p对ADSCs的成骨分化具有抑制作用，靶向BMP2基因是可能的分子机制，miR-95-5p可能成为研究ADSCs成骨分化调控机制的新靶点，抑制miR-95-5p也有望成为促进ADSCs成骨分化的治疗手段。