MEI1在宫颈癌中高表达并促进宫颈癌细胞的增殖与迁移侵袭*

陈丽萍， 贺晓琪

华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，武汉 430022

宫颈癌是全球第4大最常见的女性恶性肿瘤，每年大约25万女性因宫颈癌死亡[1]。近年来宫颈癌发病有年轻化的趋势，由于宫颈癌发病早期常无典型症状及体征，易误诊或漏诊，严重威胁女性生命健康，高危型人乳头瘤病毒(HPV)持续感染是其主要危险因素。尽管近年来宫颈癌的预防、筛查、诊断等方面均取得明显进步，使宫颈癌得以早期发现和治疗，宫颈癌的发病率和死亡率明显下降，但进展期宫颈癌患者治疗后的5年生存率仍不尽人意[2]，因此开发可显著抑制宫颈癌进展，并提高宫颈癌患者生存期的治疗方法迫在眉睫。减数分裂抑制物1(meiosis inhibitor 1，MEI1)首先被报道参与细胞减数分裂周期，它的表达异常可导致细胞分裂异常并影响机体的生育能力。MEI1基因编码1274个氨基酸，含有5个BRCT结构域，可参与真核生物DNA的损伤修复[3]。新近有文献报道HPV感染的宫颈癌组织中MEI1表达量高于HPV阴性的宫颈癌组织[4]，而MEI1在宫颈癌进展过程中的作用尚不清楚。

宫颈癌的增殖与转移与肿瘤细胞的细胞周期以及上皮间质转化(EMT)异常激活存在密切的联系。Cyclin D1属于细胞周期蛋白家族的一员，通过控制细胞G1期向S期的进展，对细胞周期起着至关重要的作用[5-6]；增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)同样参与细胞周期以及DNA复制[7-9]；EMT是肿瘤发生转移的重要机制之一，HPV16 E6和E7感染宫颈癌细胞后，细胞形态发生改变，出现与EMT诱导相似的α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)上调和E-钙粘蛋白(E-cadherin)下调的表达水平变化[10]；E-cadherin作为上皮细胞的粘附分子，其表达下调被认为是EMT活化的基础，而金属基质蛋白(MMP)可进一步降解基质蛋白。此外，细胞骨架蛋白表达上调，为肿瘤细胞的迁移提供便利。

本研究分析了MEI1在宫颈癌组织及其邻近正常组织中的表达，并通过GEPIA数据库分析MEI1表达量与宫颈癌患者生存期的关系，再进一步通过细胞实验探讨MEI1促进宫颈癌细胞的增殖与迁移、侵袭能力的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞 人宫颈癌细胞C-33A细胞、HCC-94细胞、HeLa细胞、Caski细胞、ME-180细胞和SiHa细胞均购买于盖宁生物。

1.1.2 药物与试剂 DMEM细胞培养液、胎牛血清购自Sigma公司；CCK-8试剂盒购买于MCE公司；Transwell板购于康宁公司；基质胶购于BD公司；pcDNA3.1和pcDNA3.1-MEI1(过表达MEI1)、psPAX2和pMD2G(表达载体包装体系所含片段)、pLKO.1-NO和pLKO.1-shMEI1(敲减MEI1)质粒均购于生物风有限公司；MEI1引物、GAPDH引物、PCNA引物、Cyclin D1引物、E-cadherin引物、N-cadherin引物、Vimentin引物、MMP2引物、MMP-9引物、MMP-14引物均购于武汉奥科生物有限公司；RNA提取试剂盒购于TaKaRa公司；RNA逆转录试剂盒(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit)以及Universal SYBR© qPCR Master Mix试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司；一抗GAPDH(10494-1-AP)、MEI1(13456-1-AP)、PCNA(10205-2-AP)、CyclinD1(60186-1-Ig)、E-cadherin(20874-1-AP)，N-cadherin(22018-1-AP)、Vimentin(10366-1-AP)及辣根过氧化物酶标记的羊抗兔/鼠二抗均购于三鹰生物科技有限公司；Western blot试剂盒及BCA蛋白浓度测量试剂盒购自碧云天生物技术公司。

1.1.3 临床标本 本实验中所有组织标本均来源于华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科诊断为原发性宫颈癌患者的手术切除组织标本，排除合并其他恶性肿瘤、新辅助化疗及伴有心、肝、肾等重大疾病患者。本研究经过协和医院伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 基于生物信息学分析MEI1在宫颈癌组织的表达及其对患者生存期的影响 在GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)数据库中分析MEI1在宫颈癌及正常组织的表达差异。选定宫颈癌(CESC)，设定阈值log2FC=1，P<0.01，纳入数据库中正常宫颈组织与宫颈癌组织数据即可得到基因表达箱线图；将GEPIA数据库资料分析所得宫颈癌MEI1表达量中位数值定为MEI1高/低表达阀值，以月数为横坐标、生存率为纵坐标绘制出生存曲线图。

1.2.2 细胞系以及培养方法 将宫颈癌细胞系C-33A细胞，HCC-94细胞、HeLa细胞、Caski细胞、ME-180细胞和SiHa细胞培养于含10% FBS的DMEM中，且均在饱和湿度以及含5% CO2和37℃的细胞培养箱中培养。

1.2.3 病毒包装 胰酶消化、收集对数生长期293T细胞，于6 cm细胞培养皿中生长至60%融合度时进行转染。按照病毒包装以及转染试剂要求，plKO.1-NO/pLKO.1-shMEI1∶psPAX2∶pMD2G=4∶3∶1混合后，转染293T细胞，4 h后更换新鲜DMEM培养液，48 h收集细胞上清用于感染宫颈癌细胞。

1.2.4 稳定转染过表达及敲减细胞系构建 胰酶消化处于对数生长期的HCC94和ME-180细胞，按要求进行转染，24 h后更换新鲜培养液，采用嘌呤霉素(2 mg/L)持续筛选，2周后以qRT-PCR以及Western blot检测转染效率。

1.2.5 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测 采用qRT-PCR检测MEI1、GAPDH、PCNA、Cyclin D1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-2、MMP-9、MMP-14基因的mRNA表达水平。采用Trizol法提取总RNA，反转录为cDNA，进行PCR扩增反应。以GAPDH为内参基因，反应条件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 5 s，70 ℃ 30 s，40个循环，采用2-ΔΔCt法计算基因表达水平，实验重复3次。

1.2.6 免疫组化检测 所有入选患者的宫颈癌组织来源于华中科技大学同济医学院附属协和医院妇产科，诊断为原发性宫颈癌。取手术切除的组织进行石蜡包埋，制备组织切片，以SP两步法进行免疫组化染色,以磷酸盐缓冲液(PBS，pH7.4)作为阴性对照。加入兔抗人MEI1多克隆抗体(稀释度1∶20，Abcam公司，ab198184)，4℃孵育过夜，经PBS清洗后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，以PBS清洗后加入DAB显色液，避光室温孵育2～3 min。MEI1阳性表达细胞呈棕黄色或棕褐色，与阴性对照一样未着色判定为阴性。

1.2.7 Western blot检测 取处理后的细胞，加入RIPA裂解液冰浴30 min，待细胞充分裂解后，4℃ 1.2×105r/min，离心10 min，取上清，BCA法蛋白定量，SDS-PAGE电泳1.5 h，使用PVDF膜转膜1.5 h，室温下用含5%脱脂奶粉的TBST封闭1 h，一抗MEI1以1∶2000配制，PCNA以1∶2000配制，Cyclin D1以1∶3000配制，E-cadherin以1∶2000配制，N-cadherin以1∶2000配制，Vimentin以1∶2000配制，GAPDH以1∶5000配制，4℃孵育过夜，TBST溶液洗3次，每次5 min，二抗以1∶4000稀释配制，室温孵育1 h，TBST溶液洗3次，每次5 min，曝光显影。

1.2.8 CCK-8检测细胞活力 取分组处理后的细胞，接种于96孔板，每孔接种2.0×103个细胞，设4个平行复孔。分别于相应的时间避光加入CCK-8溶液50 μL；孵育4 h后，以多功能酶标仪检测450 nm波长处的吸光度值，据此评估细胞活力。

1.2.9 平板克隆实验检测细胞增殖 取处理后的细胞，接种于6孔板，每孔500个细胞，设置3个平行复孔。培养2周后用4%多聚甲醛固定10 min，1%结晶紫染色1 h，用Image J软件计数每孔细胞克隆数，取平均值。

1.2.10 划痕实验检测细胞迁移 将处理后的细胞接种于12孔板，每孔接种10.0×104个细胞，设置3个平行复孔，24 h后用200 μL枪头画直线，用PBS洗3遍洗去划掉的细胞，加入无血清培养液培养。48 h后测量划痕宽度，计算实验前后划痕宽度比。

1.2.11 Transwell检测细胞的迁移、侵袭能力 取处理后的细胞，每个加入或者不加基质胶的Transwell小室加入无血清培养的10.0×104个细胞，设2个平行复孔，下室加入500 μL 10%FBS-DMEM，12 h后以1%结晶紫染色，100倍镜下观察视野中的迁移、侵袭细胞数目，细胞迁移率=实验组shRNA迁移细胞数目/对照组NC迁移细胞数×100%，细胞侵袭率=实验组MEI1迁移细胞数目/对照组Vector迁移细胞数×100%。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 MEI1在正常组织以及癌旁组织的表达明显低于癌组织

在GEPIA(http：//gepia.cancer-pku.cn/)数据库中分析MEI1在宫颈癌组织以及正常组织的表达量，其结果提示肿瘤组织中MEI1的表达量明显高于邻近正常组织(图1A)。使用免疫组化检测宫颈癌组织以及正常组织的MEI1表达量，结果显示MEI1在肿瘤组织表达量明显高于正常组织(图1B)。qRT-PCR检测10例我院妇产科宫颈癌患者的肿瘤组织以及癌旁组织，结果(图1C)显示肿瘤组织中MEI1的表达量明显高于癌旁组织[(24.68±0.70)vs.(2.25±0.27)，P<0.01]。Western blot检测4例宫颈癌组织以及配对的正常组织，结果显示肿瘤中MEI1高表达(图1D)，使用GEPIA分析MEI1表达量与患者总生存期的关系，提示高表达MEI1患者预后较差(图1E)。上述结果初步提示MEI1可能参与宫颈癌的进展。

A：GEPIA数据库中分析MEI1在宫颈癌中表达高于正常组织；B：免疫组化示MEI1在肿瘤组织表达量明显高于正常组织；C：qRT-PCR示MEI1在宫颈癌组织中表达量明显高于癌旁组织；D：Western blot实验显示MEI1在宫颈癌组织中高表达，T为宫颈癌组织，N为正常癌旁组织；E：利用GEPIA数据库绘制MEI1高表达及低表达患者生存曲线

2.2 MEI1在各宫颈癌细胞系中的表达

以Western blot检测各宫颈癌细胞系中MEI1的表达量，其结果(图2A)提示MEI1在HCC-94细胞中高表达，在ME-180细胞中低表达；以qRT-PCR进一步确定MEI1在各细胞系中的表达量[C-33A，(4.25±0.13)；HCC-94，(14.13±0.56)；HeLa，(8.65±0.25)；CasKi，(4.98±0.33)；ME-180，(2.23±0.13)；SiHa，(8.12±0.21)]。基于以上结果，构建转染对照shNC的HCC-94细胞(HCC-94-shNC，对照组)，转染shMEI1敲减MEI1的HCC-94细胞(HCC-94-shMEI1，敲减MEI1组)和转染pcDNA3.1-的ME-180细胞(ME-180-vector，对照组)，转染pcDNA3.1-MEI1过表达MEI1的ME-180细胞(ME-180-MEI1，过表达MEI1组)。使用Western blot检测上述细胞中MEI1表达情况，证明敲减以及过表达效率(图2B)，qRT-PCR进一步证实上述结果[HCC-94-shNC，(12.24±0.23)vs.HCC-94-shMEI1，(2.26±0.12)；ME-180-vector，(2.16±0.23)vs.ME-180-MEI1，(18.56±0.45)]。

A：MEI1在乳腺癌细胞系中的表达；B：在宫颈癌细胞中敲减或过表达MEI1，NC：HCC-94-shNC，shRNA：HCC-94-shMEI1，vector：ME-180-vector，MEI1：ME-180-MEI1；**P<0.01

2.3 MEI1调控宫颈癌细胞的增殖

采用CCK-8检测HCC-94-shNC、HCC-94-shMEI1、ME-180-vector、ME-180-MEI1细胞的增殖能力，结果(图3A)显示，MEI1过表达可明显促进宫颈癌细胞ME-180的增殖活力[(3.023±0.256)vs.(2.254±0.264)，P<0.01]，敲减MEI1则显著抑制HCC-94细胞的增殖活力[(1.364±0.265)vs.(2.124±0.326)，P<0.01]。平板克隆实验(图3B、3C)也证明MEI1过表达可增加宫颈癌细胞ME-180集落形成的数目(356±23)vs.(106±12)，P<0.01)，敲减MEI1抑制HCC-94细胞集落形成[(56±10)vs.(101±9)，P<0.01)。随后，检测MEI1对细胞周期蛋白Cyclin D1和PCNA表达的影响，Western blot结果(图3D)提示MEI1过表达可上调ME-180细胞中Cyclin D1和PCNA表达，而敲减MEI1抑制HCC-94细胞中上述两种蛋白的表达，qRT-PCR(图3E)也同样证明MEI1过表达可提高ME-180细胞中Cyclin D1和PCNA的mRNA水平[(8.56±0.78)vs.(2.23±0.25)，P<0.01；(13.26±0.89)vs.(3.45±0.21)，P<0.01]，而敲减MEI1则降低HCC-94细胞中Cyclin D1和PCNA的mRNA表达量[(2.12±0.23)vs.(7.59±0.45)，P<0.01；(3.12±0.36)vs.(8.12±0.82)，P<0.01]。上述结果证明MEI1可促进宫颈癌细胞的增殖，并可能是通过调控Cyclin D1和PCNA的表达来实现。

A：CCK-8实验检测细胞活力；B，C：细胞克隆形成实验；D：Western blot检测Cyclin D1和PCNA蛋白表达；E：qRT-PCR检测Cyclin D1和PCNA的mRNA表达；NC：HCC-94-shNC，shRNA：HCC-94-shMEI1，vector：ME-180-vector，MEI1：ME-180-MEI1；**P<0.01

2.4 细胞划痕实验检测MEI1对宫颈癌细胞迁移能力的影响

利用细胞划痕实验初步检测MEI1对宫颈癌细胞迁移能力的影响，48 h后测量细胞划痕宽度，计算实验前后划痕宽度比，结果显示，对照组细胞HCC-94-shNC的迁移速度明显高于MEI1敲减后的宫颈癌细胞(HCC-94-shMEI1)迁移速度[划痕宽度比(8.26±1.63)%vs.(35.63±6.25)%，P<0.01，图4A]；而过表达MEI1则可明显增加宫颈癌细胞(ME-180-MEI1)的迁移能力[划痕宽度比(15.34±3.23)%vs.(42.26±5.58)%，P<0.01，图4B]。以上实验初步说明MEI1可促进宫颈癌细胞的迁移。

NC：HCC-94-shNC；shRNA：HCC-94-shMEI1；vector：ME-180-vector；MEI1：ME-180-MEI1；**P<0.01

2.5 Transwell实验证明MEI1促进宫颈癌细胞的转移

为进一步证实上述结果，采用Transwell实验进一步探究MEI1对宫颈癌细胞迁移、侵袭能力的影响。

结果显示，与对照组(HCC-94-shNC)相比，敲减MEI1后HCC-94-shMEI1细胞的迁移明显降低[(35±8)vs.(95±12)，P<0.01]，其侵袭能力也明显降低[(30±7)vs.(105±21)，P<0.01]，见图5A；而过表达MEI1不仅可以上调宫颈癌细胞ME-180-MEI1的迁移能力[(480±32)vs.(121±20)，P<0.01)，也可促进其侵袭能力[(476±56)vs.(103±6)，P<0.01]，见图5B。

NC：HCC-94-shNC；shRNA：HCC-94-shMEI1；vector：ME-180-vector；MEI1：ME-180-MEI1；**P<0.01

2.6 MEI1调控宫颈癌细胞EMT

EMT广泛参与多种肿瘤转移过程，本实验探究了MEI1对EMT相关蛋白的表达调控。结果显示，MEI1过表达可显著上调ME-180细胞中金属基质蛋白MMP-2、MMP-9、MMP-14等蛋白的表达，在HCC-94细胞中敲减MEI1后，上述蛋白的表达量明显降低(图6A)；qRT-PCR检测结果也符合同样的变化特征(图6B)。此外，Western blot(图6C)和qRT-PCR(图6D)结果也证明MEI1过表达可显著抑制ME-180细胞中上皮样蛋白E-cadherin的表达，而明显促进其基质样蛋白N-cadherin和Vimentin的表达；MEI1敲减后则可上调HCC-94细胞中E-cadherin的表达，下调其N-cadherin以及Vimentin的表达。综上所述，MEI1可能是通过参与调控EMT进而调控宫颈癌细胞的迁移侵袭。

A：Western blot检测金属基质蛋白的表达；B：qRT-PCR检测金属基质蛋白mRNA表达；C：Western blot检测cadherin、Vimentin蛋白表达；D：qRT-PCR检测cadherin、Vimentin mRNA表达；NC：HCC-94-shNC；shRNA：HCC-94-shMEI1；vector：ME-180-vector；MEI1：ME-180-MEI1；**P<0.01

3 讨论

DNA双链断裂的程序性启动是细胞进行减数分裂同源重组的重要途径，这对机体第一次减数分裂以及生育时染色体的分离是必不可少的[11]。MEI1是MEI蛋白家族的一员，参与上述细胞生理过程。有研究者发现MEI1的错义突变可以导致不孕，这可能是MEI1突变后不能正常维持细胞减数分裂的生理过程所致[12]。

有研究发现MEI1双等位基因突变可引起复发性雄性单精子性葡萄胎、流产以及人类不育的现象[13]，这为人类生殖与疾病方面研究提供新思路。

EMT作为重要的生理机制，不仅可影响胚胎的生长发育，同时在慢性炎症以及肿瘤转移等多方面发挥重要的作用[14]。肿瘤细胞转移的分子机制，一般通过抑制上皮样分子的表达，从而使细胞与基质或者细胞与细胞之间的粘附以及紧密连接减弱或者消失，使细胞获得迁移的潜能[15-16]。细胞在经历EMT时除了发生上述改变，也会表达基质样蛋白促进细胞形态以及迁移行为的改变，比如Vimentin、N-cadherin、fibronectin等关键基质样基因的表达[16-18]。EMT在宫颈癌淋巴结转移中发挥着重要作用，盆腔淋巴结转移是宫颈癌复发或死亡的重要危险因素，EMT可引起宫颈癌患者淋巴结转移，是预测早期宫颈癌患者总生存期和无病生存期的独立预后因素。多项研究表明，宫颈癌中EMT的发生增加了癌症干细胞(cancer stem cells，CSC)亚群，从而增加了宫颈癌的转移潜能。EMT可导致宫颈癌细胞耐药和耐辐射，抑制宫颈癌细胞的EMT可增加其对辐射和药物敏感，这种致敏作用可以提高宫颈癌患者的生存率[10]。

目前关于MEI1在肿瘤中作用的研究甚少，有文献报道相对于HPV阴性的宫颈癌组织，MEI1在HPV感染的宫颈癌细胞中高表达，这提示我们MEI1可能参与HPV阳性宫颈癌的疾病进程[4]。目前尚未有关于MEI1与EMT相关作用机制的研究报道，我们的研究发现MEI1在宫颈癌组织的表达量明显高于邻近正常组织，首次证明MEI1可以促进宫颈癌细胞的增殖与迁移、侵袭能力，并在机制上首次提出MEI1可能通过上调细胞周期蛋白Cyclin D1以及PCNA促进宫颈癌细胞的增殖，并可能通过激活EMT促进宫颈癌细胞的转移，这将为宫颈癌的治疗提供新的靶点及治疗策略。