土鸡蛋中添加剂斑蝥黄的色谱 质谱联用检测方法研究

◎ 陈庚超，叶李扬，黄智娟，李星颖，刘起文

（1.黄埔海关技术中心，广东 东莞 523000；2.东莞理工学院，广东 东莞 523808）

近年来，出现了斑蝥黄添加剂被用于蛋鸡养殖，以加深鸡蛋蛋黄颜色，商家打着“土鸡蛋”“柴鸡蛋”“草鸡蛋”等不符合实际的名号抬高鸡蛋价格、欺骗消费者的事件[1]。“斑蝥黄”又被称为角黄素（Canthaxanthin，分子式C40H52O2，CAS 号：514-78-3），斑蝥黄是贝壳类、部分鱼类、水藻类等生物体内能够自然代谢生成的类胡萝卜素物质[2]。斑蝥黄常规条件下显橙红色，同时由于其具有较好的稳定性，可用于加工类食品，如肉制品、调味料等食物的调色工艺中，也可应用于养殖业中，起到使鸡蛋的蛋黄颜色更鲜红、使动物鲜肉的色泽更显红润等效果[3]。斑蝥黄之所以能在畜禽养殖中发挥着很好的作用，是因为它具有以下基础优点。①均匀分布性。斑蝥黄中的活性成分角黄素能够均匀地分布在淀粉包膜的明胶和碳水化合物中，成为球形或串珠状的小颗粒，这种独特的性能确保了斑蝥黄的稳定性和成品极佳的均匀分布性。②较强的稳定性。斑蝥黄的稳定特性增强了角黄素对抗外界不利因素及耐受苛刻加工条件的能力，使其能够应用于养殖业和食品加工业中。③溶解性。角黄素能够溶解在多种溶剂中形成均一稳定分散体系，因此在禽用饲料中极易被混合，且分布均匀[4]，因此可以较为广泛地应用于养殖业和食品加工业中。本文利用操作简便的液液萃取净化方法结合超高效液相色-质谱/质谱联用仪建立了准确、高效、及时和科学的检测方法，这对于土鸡蛋等农产品安全的检测监管具有重要的 现实意义。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

Preminer+Acquity 超高效液相色-质谱/质谱联用仪（美国Waters公司）、多功能台式高速离心机（Thermo Scientific 公司）、MS304TS/02 电子天平（梅特勒-托利多公司）、AVANT 超声波清洗器（WIGGENS 仪器公司）、FE28 pH 计（梅特勒-托利多仪器公司）及Milli-Q IQ7000 超纯水机（默克化工公司）。

1.2 试剂耗材

斑蝥黄标准品，CAS 号：514-78-3，纯度大于99%。甲醇（色谱纯）、正己烷（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、甲酸（分析纯）、乙酸（分析纯）、乙酸铵（分析纯）、丙酮（色谱纯）、乙酸乙酯（色谱纯）及氨水（分析纯）。本文中涉及使用的实验用水除特殊说明外均为超纯水。

1.3 目标化合物标准溶液的配制

称取斑蝥黄标准品适量于容量瓶中，甲醇做溶剂配制成1 000 mg·L-1的标准储备液溶液，于4℃避光保存。吸取适量斑蝥黄标准储备液用甲醇做溶剂配制成浓度为10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的系列标准工作溶液。

1.4 样品前处理实验

取具有代表性的生鸡蛋约500g 煮熟，冷却后剥壳，用高速组织捣碎机充分捣碎、混匀。

准确称取该类样品5.00 g 于50 mL 离心管中，准确加入20 mL 乙腈并涡旋1 min 后再超声提取30 min； 然后在10 000 r·min-1充分离心5 min。取5 mL 上述离心上清液，加入5 mL 正己烷，涡旋1 min 后充分离心5 min，取约1.00 mL 下层澄清的萃取溶液过0.22 μm孔径的有机滤膜后，待上机测试[5]。

1.5 仪器条件的优化

1.5.1 超高效液相色谱仪器条件的优化

在液相色谱的仪器方法优化过程中，流动相非常重要，实验室论证了多种流动相，如超纯水、0.1%的甲酸水溶液、0.2 mmol·L-1的醋酸铵水溶液作为水相和以甲醇、乙腈作为有机相的多种不同组合作为流动相来进行分析测试比较，设置了不同梯度洗脱程序的仪器条件进行分析测试[6]，在充分的实验后比较目标化合物峰形和峰面积，最终得出了以0.1%的甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈溶液作为最佳的液相色谱仪器条件。

具体超高效液相色谱条件：Waters 分析色谱柱UPLC BEH C18（规格为2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；进样量：5 μL；柱温：40 ℃；流动相：0.1%甲酸水溶液+0.1%甲酸乙腈溶液；超高效液相梯度洗脱程序见表1，流速为0.30 mL·min-1[7]。

表1 超高效液相梯度洗脱程序表

1.5.2 三重四极杆质谱参数的优化

将斑蝥黄标准工作液注入仪器，经多次优化各个参数，使之达到最佳检测出峰效果。理想的仪器参数为电喷雾电压：3.5 kV；离子源温度：150 ℃；锥孔反吹气流量：65 L·h-1；脱溶剂气温度：300 ℃；脱溶剂气流量：650 L·h-1；碰撞气流量：0.10 mL·min-1。

需要用到的高纯氮可使用高纯液氮或能提供等效气体的气体发生器，仪器设备使用前应调节各气体流量等条件以使质谱灵敏度、分辨率达到最佳检测需求[7]。模式选择：电喷雾ESI+、MRM 模式，详细质谱参数设置见表2[8]。

表2 斑蝥黄化合物质谱参数信息表

2 结果与分析

2.1 结果计算和表述

本方法按标准曲线外标法定量，按式（1）计算样品中斑蝥黄残留量。计算结果需扣除空白值。

式（1）中，W-样品中目标化合物残留量，单位为 μg·kg-1；C-斑蝥黄的仪器上机浓度，单位为μg·L-1； V-溶剂提取液总体积，单位为mL；M-实验中称取样品质量，单位为g。

2.2 斑蝥黄线性范围

本实验配制标准溶液浓度为10 ng·mL-1、 20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1和200 ng·mL-1的标准工作溶液浓度系列，按实验过程中确定的方法经超高效液相色谱-质谱/质谱联用仪分析测试后，建立拟合曲线。结果显示，目标化合物斑蝥黄的线性相关系数即R2≥0.99，结果符合实验室开展相关检测的实验要求，本方法的线性定量范围为10 ～200 ng·mL-1。

斑蝥黄标准工作溶液理想色谱图，如图1 中所示。

图1 10 ng·mL-1 的斑蝥黄标准品的色谱图

2.3 目标化合物检出限计算

采用1.00 ng·mL-1标准溶液色谱图，根据参考公式LOD=3S/N（信噪比）来计算检出限[9]，确定本方法斑蝥黄的检出限5.00 μg·kg-1，定量限为10 μg·kg-1。

2.4 精密度、回收率等参数的实验分析

准备制备好的不含有斑蝥黄色素的鸡蛋样品，称取样品约5.00 g 共计20 份，选取其中2份作为对照实验样品，剩余的18 份样品平均分成3 组，按“3水平添加6平行实验”的原则进行目标化合物添加回收实验，按本文所述的前处理实验进行目标化合物的提取分离，制成10 μg·kg-1、20 μg·kg-1和100 μg·kg-1的3 组不同浓度的样品回收率试验[10]，10 ng·mL-1样品加标色谱图见图2。最后分析数据结果显示平均回收率均在85%～105%、精密度RSD ≤5（n=6），具体结果的回收率和精密度参数见表3[11]。

图2 10 ng·mL-1 的斑蝥黄的样品加标色谱图

表3 加标回收率和结果精密度表（n=6）

3 结论

本文建立了以液液萃取净化样品的前处理方法，使用超高效液相色谱串联三重四极杆质谱联用仪对土鸡蛋中添加剂斑蝥黄进行了分析测试，最后取得了较好的实验结果。结果表明，该方法具有前处理简单、提取效率较高、操作快捷方便等优点，还具有定性定量准确、灵敏度高等特点。本实验的分析方法提高了鸡蛋中添加剂斑蝥黄的检测技术水平，可以为市场监管提供较强的技术支撑。