子痫前期外周血GLUT-1表达水平与代谢指标的相关性

罗沛芬 陈小兰 黄文

妊娠高血压综合征，是一种由多种原因引起患者妊娠20 周后出现血压升高及伴随症状的疾病，随着疾病的发展可进展为子痫前期，并可出现蛋白尿、头痛、眼花、恶心、呕吐、上腹不适等症状。Cao［1］等人研究发现在高血压患者中葡萄糖有氧酵解过程产生的ATP 少于正常细胞每摩尔葡萄糖经酵解产生36 mol ATP，同时乳酸、丙酮酸等糖酵解产物水平升高，表明高血压机体内存在葡萄糖酵解异常。葡萄糖摄取和转运主要依靠葡萄糖转运体介导［2］。转运蛋白-1（Glucose transporter-1，GLUT-1）是机体主要的葡萄糖转运蛋白。Hien［3］等人在动物实验中证实血管平滑肌细胞中葡萄糖摄取降低可导致葡萄糖转运蛋白GLUT-1 升高。这表明，机体处高血压状态时在胰岛素抵抗或葡萄糖稳态改变的情况下，可能发生葡萄糖转运蛋白GLUT-1 表达的改变。本研究纳入妊高症及子痫前期患者探究GLUT-1 表达水平差异及其与代谢指标的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年3月至2019年4月本院收治的100 例子痫前期患者设为子痫前期组，纳入标准：①所有患者均符合中华医学会妇产科学分会2015年版《妊娠期高血压疾病诊治指南》［4］中“子痫前期”的诊断标准；②年龄在25～30 岁；③单胎妊娠；④白蛋白≥40 g/L；⑤血钙（2.25～2.75）mmol/L。排除标准：①合并心、脑等严重的器质性病变者；②原发性高血压者；③合并其他自身免疫性疾病或严重感染者；④凝血功能障碍者。另选取同期于本院健康体检的人群100 例，设为对照组。纳入标准：①年龄在25～30 岁；②单胎妊娠。排除标准：①合并糖尿病、高血压、高脂血症等；②合并代谢性疾病；③既往子痫前期病史；④具有心、肝、肾等功能障碍。研究对象均签署知情同意书，研究经本院医学伦理委员会审批通过。

1.2 代谢指标

1.2.1GLUT-1mRNA 表达水平测定

收集所有受试者外周静脉血样本2 mL；在4℃，1 000 r/min 的条件下离心10 min，使用TRIzol 从全血中分离总RNA。使用美国BioTek Synergy™H1 杂交解读器测定RNA 纯度。使用日本Takara Biotechnology 公司生产的PrimeScript RT 试剂盒将RNA 样本逆转录；反应条件：42℃20 min，99℃5 min，72℃10 min，获得cDNA 模板。使用美国Thermo Fisher Scientific 生产的SYBR Green PCR Master Mix 试剂盒和ABI 7500 Real -Time PCR 系统检测GLUT-1 mRNA相对于GAPDH的水平；定量测量使用2-ΔΔCt方式；反应条件：94℃预变性60 s，98℃变性10 S，58℃退火2 s，74℃延伸30 s，扩增30 个循环，74℃最终延伸7 min。引物序列为：GLUT-1 上游引物为5′-CAAACAAAGGACCAAGAAATT-3′，下游引物为5′-UUUCUUGGUCCUUUGUUUGT-3′；GAPDH 前 进，5′-TCCCATCACCATCTTCCAG-3′和反向，5′-GGTATCCATCGCCATGCTC-3′。

1.2.2 免疫单边印迹法检测GLUT-1 蛋白表达

将样品悬浮在十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）缓冲液（125 mmol/L Tris-HCl，pH 6.8，4%SDS，20%甘油，100 mmoL/L PMSF，10 mg/mL 抑肽酶，1 mg/mL 亮肽素，1 mg/mL胃抑素A）中；加入FLAG 抗体（1∶1 000 稀释）和内参B-actin 抗体（1∶4 000 稀释）4℃孵育过夜；后用武汉艾美捷科技有限公司GLUT-1 抗血清（纯化的山羊抗二抗抗体1∶10 000 稀释）进行免疫印迹。采集图像后，用凝胶成像仪对免疫印迹条带灰度值进行分析。

1.2.3 代谢指标检测

采用全自动生化分析仪（美国，贝克曼库尔特，AU5800）测量患者24 h 尿蛋白、尿酸、谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血清肌酐、乳酸、丙酮酸水平。

1.3 观察指标

①两组患者临床资料比较。②GLUT-1mRNA表达水平与子痫前期代谢指标乳酸水平、丙酮酸水平的相关性。③GLUT-1 蛋白表达水平与子痫前期代谢指标乳酸水平、丙酮酸水平的相关性。

1.4 亚分组

以妊高症严重程度分组，分析GLUT-1 表达水平与妊高症严重程度及代谢指标的相关性。

1.5 统计学方法

使用SPSS 22.0 进行数据处理；计量资料用（±s）表示，使用t检验进行比较；两变量间进行Pearson 相关分析；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 子痫前期组与对照组患者临床资料比较

子痫前期组GLUT-1 表达水平高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；代谢指标乳酸水平、丙酮酸水平子痫前期组高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），其余指标比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组患者临床资料比较（±s）Table 1 Characteristics of the two groups of patients（±s）

表1 两组患者临床资料比较（±s）Table 1 Characteristics of the two groups of patients（±s）

临床资料年龄（岁）身高（cm）体重（kg）BMI(kg/m2)收缩压(mmHg)舒张压(mmHg)丙酮酸（mmol/L）乳酸（mmol/L）谷丙转氨酶（mg/L）尿酸（μmol/L）谷草转氨酶(mmol/L)血清肌酐（μmol/L）尿蛋白(g/24 h)肾小球滤过率［mL/（min-1。GLUT-1mRNA表达水平GLUT-1 蛋白表达子痫前期组（n=100）27.56±1.14 156.27±4.62 63.75±4.27 27.21±3.26 149.16±5.11 98.63±4.92 0.12±0.02 1.09±0.06 38.74±4.32 226.89±74.40 33.21±2.44 115.47±12.82 0.67±0.21 131.54±9.30对照组（n=100）27.84±1.63 157.01±5.13 62.87±5.41 26.84±3.84 124.87±14.39 84.18±6.80 0.07±0.02 0.94±0.05 36.17±2.23 219.45±56.87 31.47±2.14 62.94±19.71 0.25±0.02 134.51±8.27 t 值0.939 0.753 0.872 0.509 9.773 11.557 11.346 14.472 4.483 0.612 3.988 14.715 19.746 1.769 P 值0.353 0.455 0.387 0.613＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.542＜0.001＜0.001＜0.001 0.082 1.00±0.08 0.70±0.15 0.81±0.09 0.64±0.13 11.054 3.023＜0.001 0.003

2.2 GLUT-1 mRNA 表达水平与子痫前期代谢指标乳酸水平、丙酮酸水平的相关性

GLUT-1mRNA 表达水平与子痫前期代谢指标乳酸水平、丙酮酸水平呈正相关（P＜0.05）。见图1。

图1 GLUT-1 mRNA 与乳酸及丙酮酸水平相关性Figure 1 GLUT-1 mRNA is associated with lactate and pyruvate levels

2.3 GLUT-1 蛋白表达水平与子痫前期代谢指标乳酸水平、丙酮酸水平的相关性

GLUT-1 蛋白表达水平与子痫前期代谢指标乳酸水平、丙酮酸水平呈正相关（P＜0.05），见图2。

3 讨论

图2 GLUT-1 蛋白与乳酸及丙酮酸水平相关性Figure 2 Glut-1 protein is associated with lactate and pyruvate levels

妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的疾病，以全身小血管痉挛为病理特性，疾病类型包括妊娠期高血压、子痫前期等，严重影响母婴健康，是孕产妇和围生儿发病和死亡的主要原因之一［5-6］。Park［7］等人证明在中度高血压的动物模型中血管平滑肌细胞所产生的胰岛素刺激的葡萄糖摄取改变，这表明在高血压状态下葡萄糖转运蛋白表达及血管葡萄糖摄取发生了改变。Kevin［8］等人在高血压大鼠动脉样本中发现葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取发生了实质性变化，证实高血压中葡萄糖转运蛋白表达变化独立于胰岛素信号传导，依赖于高血压状态。因此，推测在妊高症及子痫前期中GLUT-1 的表达水平也依赖于血压变化。

本研究结果显示对比健康人群与子痫前期患者GLUT-1 表达水平、代谢指标乳酸水平、丙酮酸水平发现妊高症患者均高于健康受试者。分析认为：在Palaniappan［9］等人的研究中指出在妊娠期高血压疾病患者中存在糖代谢异常、胰岛素抵抗等。1 mol 葡萄糖有氧酵解过程产生的ATP 少于正常人体，机体为维持ATP 平衡状态，可适应性加快该葡萄糖酵解过程［10-11］。葡萄糖与氧气在短时间内大量消耗，可引起患者不同程度的低氧和低血糖状态。机体低氧状态可促发机体无氧酵解，产生乳酸、丙酮酸等。而低血糖状态可引起GLUT-1mRNA 和蛋白上调，加速葡萄糖转运。因此，在子痫前期患者中GLUT-1 表达水平、代谢指标乳酸、丙酮酸水平高于对照组人群。

Prasannarong［12］等人的研究中表明在高血压患者中存在葡萄糖酵解异常。异常状态的糖酵解过程消耗过多的氧气及葡萄糖导致机体处缺氧状态，缺氧状态可导致葡萄糖摄取和葡萄糖磷酸化（己糖激酶）和乳酸脱氢酶活性的增加，导致葡萄糖酵解过程中产生更多的乳酸及丙酮酸［13］。在Polak［14］等人的研究中指出低氧、低血糖状态虽可刺激GLUT-1mRNA 和蛋白增加，增强细胞葡萄糖转运，但两个糖酵解步骤的活性没有显著变化。证实当考虑到糖酵解途径，尤其是乳酸脱氢酶途径时，GLUT-1 mRNA和蛋白表达的上调是促进葡萄糖几乎完全转化为乳酸、丙酮酸的必要条件。

综上所述，GLUT-1 表达水平在子痫前期外周血中含量高于健康人群，并与子痫前期患者代谢指标乳酸水平、丙酮酸水平呈正相关，推测GLUT-1参与了子痫前期患者代谢过程中。葡萄糖摄取和糖酵解也是炎症性疾病的特征，在子痫前期患者中存在核转录因子κB 等炎症因子的改变，但本研究未将其纳入探讨，另外由于样本量较少且来源较单一，研究结果可能存在偏倚，因此后期需将纳入炎症因子进行大样本、多中心的研究。