lncRNA H19和lncRNA GAS5在急性缺血性脑卒中的表达及临床意义

李鹏飞 王蕾 李帆 程迎迎 张春兵，★

脑卒中（stroke），中医称之“中风”，是好发于中老年人的一种多发病、常见病与难治病。中国卒中协会2019年发布的《中国脑卒中防治报告2018》概要显示：近30年来，我国脑卒中的发病率以平均每年8.3%的速度不断上升，并有明显的年轻化趋势［1］。临床上，脑卒中分为缺血性脑卒中（ischemic stroke，IS）和出血性脑卒中（hemorrhagic stroke，HS）两大类，其中IS 作为主要类型，约占87%。目前，迫切需要寻找到高敏感、高特异的IS生物标志物。长链非编码RNA（Long non-coding RNA，lncRNA）是一种功能性非编码RNA，其长度超过200 个核苷酸，位于细胞核和胞浆内。已知lncRNA 有调控基因转录、参与基因转录后调控和参与调控蛋白质翻译及翻译后修饰等功能［2］。尽管IS 患者存在众多差异表达的lncRNAs［3-4］，但尚未有公认和明确的生物标志物。本文研究了lncRNA H19 和生长阻滞特异转录物5（growth arrest-specific transcript 5，GAS5）与IS 的关系，进一步通过体内外实验检测lncRNA H19 和GAS5 在IS患者、大脑中动脉闭塞（MCAO）模型大鼠和氧糖剥夺再灌注（OGD/R）模型PC12 细胞中的表达，探讨其是否可以作为IS 发病早期风险评估以及病情判断的指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2019年4月22日至2019年5月15日在江苏省中医院确诊的急性初发缺血性脑卒中患者23 例为IS 组。纳入标准：诊断符合2018 版中国急性缺血性脑卒中诊治指南［5］，并同时经影像学检查证实。排除标准：①短暂性脑缺血发作、出血性脑梗死等神经系统疾病者；②合并心、肺、肾、肝功能不全者；③有手术史、肿瘤病史者。同期选择江苏省中医院健康体检者33 例为对照组。排除既往有脑卒中史、手术史、头部外伤史或神经系统疾病者以及有基础疾病者。本研究经南京中医药大学附属医院伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.2 标本采集

IS 患者入院24 h 内采集外周血2 mL（EDTA-K2抗凝），一部分抗凝血由XS-800I 全血细胞分析仪检测白细胞数（WBC），一部分用于单个核细胞（PBMC）分离；普通促凝血2 mL，分离血清。同时收集在本院体检的健康人外周血。

1.3 PBMC 分离

将1 mL EDTA 抗凝血与1 mL 生理盐水混匀；2 mL Ficoll 细胞分离液（天津灏洋公司）加入到15 mL 离心管中；按照说明书提取PBMC；加入1 mL TriZol 试剂（美国Thermo Fisher Scientific 公司）涡旋混匀后-80℃保存。

1.4 生化指标检测

AU5800 全自动生化分析仪（美国Beckman 公司）测定血清甘油三脂（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、空腹血糖（GLU）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量。

1.5 大鼠及分组

选择SPF 级健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（北京维通利华公司，许可证号：SCXK（京）2016-0011），体重为（270±20）g，饲养在温度为（22±2）℃和湿度为（55±5）%的房间中，12 h/12 h 关/开光照周期。大鼠随机分为假手术组和模型组，每组5 只。

1.6 MCAO 模型

运用Zea Longa 改良栓线法［6］构建大鼠MCAO模型。以Zea Longa 确立的五分法对各组大鼠进行神经功能评分［6］，评分≥2 分者为造模成功，并将评分为1 分或5 分者剔除。再灌注24 h 后，麻醉大鼠，取出大脑，快速分离出约100 mg 缺血脑皮质，置于1.5 mL 无酶EP 管中-80℃保存待测。

1.7 PC12 细胞培养和OGD/R 模型的建立

大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞株PC12 购自北京协和细胞资源中心。含100 U/mL 青霉素、100 μg/mL链霉素和10%胎牛血清的DMEM 高糖培养基培养PC12 细胞，常规置于含5% CO2的37℃培养箱。PC12 细胞按密度1×104/mL 接种于12 孔板，正常培养基培养24 h 后，弃上清，更换无糖DMEM 培养基。将培养皿和氧浓度监测仪置于MIC-101 型细胞缺氧装置（美国Billups-rothenberg 公司），用含95% N2和5% CO2的混合气体通气（20 L/min，持续10 min），将缺氧小室置于37℃CO2培养箱中继续培养6 h。结束后，将12 孔板中液体弃去，换成正常培养基，置于CO2培养箱中常规培养24 h 以再灌注。同时正常培养基和培养条件的细胞作为对照。

1.8 RNA 提取和实时荧光定量PCR

将PBMC、脑皮质和PC12 细胞用Trizol 提取总RNA。Biophotometer plus 核酸蛋白测定仪（德国Eppendorf 公司）检测所提取RNA 的浓度和纯度。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit 反转录试剂盒（大连TaKaRa 公司）说明书，反应体系总体积20 μL，反转录体系为：4 μL 5×Prime Script buffer，1 μL Prime-Script RT mix I，1 μL Oligo dT Primer，4 μL Random 6 mers，1 μg 总RNA，DEPC 水至20 μL。反应程序为：42℃20 min，99℃5 min，4℃5 min。实时定量PCR 检测lncRNA H19 和GAS5 的表达水平。25 μL反应体系为：12.5 μL TB Green Premix Ex Taq II，1 μL cDNA，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，0.5 μL ROX Reference Dye II，10 μL ddH2O。反应程序为：95℃预变性10 min 后，95℃30 sec，60℃30 sec，72℃30 sec，循环数为35。以GAPDH 为内参。采用Quantistudio Dx 荧光定量扩增仪（美国ABI 公司）进行检测分析。目的基因表达倍数按2-ΔΔCt的公式计算得到。所有反应重复三次。所用引物序列见表1。

1.9 统计处理

采用SPSS 21.0 软件对数据进行统计。采用Shapiro-Wilk 法检验分析数据是否符合正态分布，符合正态分布的计量资料以（±s）表示，两组比较使用t检验，方差不齐时采用Welch's t 检验；非正态分布数据用中位数［M（P25～P75）］表示，两组间比较采用Mann-Whitney U 检验；计数资料用n（%）表示，用χ2检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料特征比较

IS 组患者与健康对照相比，年龄、性别以及TG含量上比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。IS 组WBC、GLU 水平显著增高，HDL-C、LDL-C 和TC 含量均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

2.2 lncRNA H19 和GAS5 在各组外周血PBMC中的表达水平

lncRNA H19 在IS 组外周血中的表达水平高于lncRNA H19 在对照组的表达水平，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1A。和对照组相比，IS 患者PBMC 中lncRNA GAS5 表达显著升高差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1B。

表2 两组临床资料特征比较［（±s），n（%）］Table 2 Demographic and clinical characteristics of IS patients and control group［（±s），n（%）］

表2 两组临床资料特征比较［（±s），n（%）］Table 2 Demographic and clinical characteristics of IS patients and control group［（±s），n（%）］

参数年龄（岁）男性（例数）WBC（109/L）GLU（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）TG（mmol/L）TC（mmol/L）对照组（n=33）61.24±1.42 16（48.48）5.85±0.23 4.88（4.57～5.31）1.41±0.04 3.36±0.11 1.75±0.18 5.08±0.12 IS 组（n=23）60.04±3.13 15（65.22）7.37±0.55 5.52（4.73～7.98）1.23±0.05 2.83±0.16 1.47±0.15 4.17±0.18 t/χ2/Z 值0.348 1.536 2.864-2.262 2.713 2.901 1.096 4.412 P 值0.73 0.22 0.01 0.02 0.01 0.01 0.28＜0.05

2.3 MCAO 模型大鼠缺血脑组织中lncRNA H19和GAS5 的表达

和假手术组相比，MCAO 模型大鼠缺血侧脑皮质中lncRNA H19 表达水平显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2A。MCAO 大鼠缺血侧脑皮质中GAS5 表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2B。

2.4 OGD/R 模型PC12 细胞中lncRNA H19 和GAS5 的表达

与对照组相比，OGD/R 处理的PC12 细胞其lncRNA H19 表达倍数显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3A。OGD/R 处理PC12 细胞GAS5 表达倍数显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3B。

图1 两组PBMC lncRNA H19（A）和GAS5（B）的表达Figure 1 The expression of lncRNA H19 and Gas5 in PBMC from IS patients and control group

图2 MCAO 模型大鼠缺血侧脑皮质中lncRNA H19（A）和GAS5（B）的表达Figure 2 The expression of lncRNA H19 and GAS5 in cortex from MCAO rats and sham group

图3 OGD/R模型PC12细胞中lncRNA H19和GAS5的表达Figure 3 The expression of lncRNA H19 and GAS5 in OGD/R-treated PC12 cells and control group

3 讨论

脑卒中危害严重，尤其见于中老年人。本团队前期研究鉴定了IS 患者外周血差异表达miRNAs，探讨了miR-106b-5p、miR-199a-5p 在诊断、治疗IS 患者［7-8］的意义，但是miR-106b-5p 和miR-199a-5p 受到何种分子调控仍不清楚。

LncRNAs 是一类转录本长度大于200 bp 的RNA，位于细胞核内或胞质中，以RNA 形式在表观遗传学上、转录及转录后等多种层面调控基因的表达。

多个临床研究和动物实验发现，IS 发生后脑组织和血液中lncRNAs 的表达水平发生了显著改变，可能作为IS 的潜在标志物［9］。最近的一项研究表明，lncRNA SNHG15 和linc-FAM98A-3 在IS 患者表达升高［10］。另一项研究发现，IS 患者PBMC 中lncRNA MIAT 表达升高，且升高与美国国立卫生研究院卒中量表（National Institute of Health stroke scale）评分、改良RANKIN 量表（mRS）评分、脑梗死体积和预后显著相关［11］。尽管有关lncRNAs 作为IS 诊断标志物的研究取得了巨大的进步，但lncRNAs 还未明确，且缺乏详细的机制探讨。

LncRNA H19 促进或抑制IS 的作用仍存争议。多个体外实验结果提示，lncRNA H19 表达升高后通过引起动脉粥样硬化［12］和激活自噬［13］促进IS 的发生。然而，最新的研究表明，lncRNA H19 高表达可保护PC12 细胞免遭OGD/R 诱导的损伤［14］。本研究发现，lncRNA H19 在IS 中表达升高。有文献报道，OGD/R 处理过的原代神经元细胞lncRNA GAS5 表达升高，通过失活Notch1 信号通路降低神经细胞的存活［15］。降低脑部lncRNA GAS5 的表达，可减少脑梗死体积，改善神经功能［16］。这些研究提示lncRNA GAS5 高表达促进IS 的发生。也有研究报道，lncRNA GAS5 可增加THP-1 单核细胞的凋亡，促进动脉粥样硬化的发生［17］。本文研究发现，GAS5在IS 患者PBMC 中表达升高。那么，lncRNA GAS5是否参与外周免疫调节值得深入研究。

本研究存在以下缺陷。样本量少，由于入组患者基础病和病因多样，需要加大样本量证实lncRNA H19 和GAS5 的诊断价值。尤其对于不同病因和分型的IS 患者，如能明确lncRNAs，将具有非常重要的临床价值；缺乏IS 后PBMCs中lncRNA H19 和GAS5 不同时间点表达特征的研究；lncRNA H19 和GAS5 如何调控miR-106b-5p和miR-199a-5p 的表达，促进IS 的发生，与免疫的关系如何，都是未来研究的重点。

综上所述，lncRNA H19 和GAS5 联合检测有望成为IS 的一个早期辅助诊断指标。lncRNA H19 和GAS5在IS中的作用机制和诊断价值值得深入研究。