不同病态窦房结综合征造模方法对SAN结构、功能的影响

毕路甲，付升旗

摘要：目的：不同病态窦房结综合征造模方法对窦房结（SAN） 解剖位置、组织细胞形态学及起搏相关离子通道功能的影响。方法：将36只兔随机分成假手术组、甲醛湿敷组和甲醛滴注组，每组12只。甲醛湿敷组兔采用甲醛湿敷法进行建模;甲醛滴注组兔采用甲醛滴注法进行建模;假手术组仅打开胸腔，剪开心包膜，不进行甲醛湿敷或甲醛滴注。HE染色观察SAN组织形态变化。采用心房调搏法测量造模前及造模后1 h的窦房传导时间（SACT） 、窦房结恢复时间（SNRT） 、校正窦房结恢复时间（SNRTc） 。采用心房调搏法测量造模前及造模后1 h的窦房传导时间（SACT） 、窦房结恢复时间（SNRT） 、校正窦房结恢复时间（SNRTc） 。Western blot检测SAN组织超极化激活环核苷酸门控非选择性阳离子通道（HCN4） 蛋白。结果：甲醛湿敷组和甲醛滴注组组织细胞形态学差异不明显（P > 0.05） 。甲醛滴注组SNRT、SNRTc和SACT高于甲醛湿敷组（P < 0.05） 。甲醛滴注组HCN4 mRNA和蛋白表达低于甲醛湿敷组（P < 0.05）。结论：甲醛湿敷法建立兔SAN损伤模型优于甲醛滴注法。

关键词：病态窦房综合征;窦房结;组织细胞形态学;离子通道

窦房结（SAN） 是各种哺乳动物心脏右心房上的一个特殊的小结节，能启动和调控心脏节律。病态窦房结综合征简称病窦综合征或病窦，又称窦房结功能障碍，是由窦房结病变而引起的一组由症状组成的心血管疾病[1～2]。对于明确诊断为病态窦房结综合征患者，无论是内科保守治疗还是外科手术介入治疗，临床患者都会受到一系列并发症的威胁，严重者可发生阿斯综合征导致晕厥，甚至猝死[3]。在探讨病态窦房结综合征治疗方法过程中，一个重要的研究手段是在动物身上复制SAN功能损伤模型。目前多采用手术方法或者药物方法建立窦房结功能损伤模型，然而对某一个体动物模型不同方式的建立对SAN以及起搏相关离子通道功能的影响尚无研究报道。本文采用甲醛湿敷法和甲醛滴注法对兔进行SAN损伤建模，比较两种不同建模方式对SAN组织细胞形态学及起搏相关离子通道功能的影响。现报道如下：

1 材料与方法

1.1 实验主要仪器和试剂

甲醛购自国药集团化学试剂有限公司;超级化激活的环核苷酸阳离子通道（HCN1） 、HCN2、HCN3、HCN4抗體以及相应的二抗购于Santa Cruz公司;RNA提取试剂TRIzol及转染试剂Lipofectamine 2000均购自武汉极捷生物科技有限公司;RIPA蛋白裂解液及BCA法蛋白浓度测定试剂盒购自金克隆（北京） 生物技术有限公司;ECL发光液购自北京伊塔生物科技有限公司;光学显微镜购于北京安麦格贸易有限公司;乌拉坦购自国药集团化学试剂有限公司;B203LED 型生物显微镜（重庆奥特光学仪器有限公司） ;DF-5A 型心脏电生理刺激仪（苏州市东方电子仪器厂） ;BL420S 生物机能实验系统（成都泰盟科技有限公司） 。

1.2 实验动物

普通级兔36只，雌雄各半，体重2.02～3.58 kg，购于吉林和元生物工程股份有限公司;许可证号：SYXK（吉） 2021-0004。将普通级兔随机分成甲醛湿敷组、甲醛滴注组和假手术组，每组12只。所有家兔适应性喂养1周后进行造模。甲醛湿敷组兔采用甲醛湿敷法进行建模，甲醛滴注组兔采用甲醛滴注法进行建模。假手术组所有兔仅打开胸腔，剪开心包膜，不进行甲醛湿敷或甲醛滴注。在整个实验过程中对动物的处置均符合医学伦理学标准。

1.3 实验方法

1.3.1 病态窦房综合征模型建立

所有兔经耳缘静脉注射 20 % 乌拉坦 4 ～5 mL/ kg 麻醉后固定，连接体表心脏Ⅱ导。第三肋骨水平为中心备皮、消毒后沿胸骨正中偏右 2 ～3 mm 纵行切开胸腔，暴露右心房，用注射器连接套管，深入心包膜腔内侧，轻轻吸取心包液。

湿敷法：用干棉签轻放于右心耳处，轻轻将心脏拨向左侧，暴露右心房与上腔静脉交界（SAN区） ，用40 %甲醛将棉签底部充分浸润，轻轻送至SAN区，湿敷3～5 min。当心率较湿敷前下降 30 %以上或出现窦性停搏、窦房阻滞或结性逸搏时取出棉签，观察心律变化情况。对未出现上述心律失常者则持续湿敷，并继续观察心律情况。

滴注法：将自制标测电极一端连接于心脏V1导联，另一端放置于窦房结区，标测窦房结电图，并固定位置，然后将自制标测电极末端接上装有40 %甲醛的微量注射器，弹丸样缓慢推注。当心率下降30 %以上或出现窦性停搏、窦房阻滞或结性逸搏时暂停推注，观察心律变化情况。对未出现上述心律失常者则持续推注，最大量至0. 03 mL。

1.3.2 SAN组织形态观察

按在建模1周后对兔进行麻醉、开胸、暴露心脏，去SAN组织制备标本。将切取的窦房结组织经生理盐水冲洗干净后立即置入4 %多聚甲醛固定，常规脱水、透明、石蜡包埋及HE染色，在光镜下观察窦房结细胞形态结构的改变。

1.3.3 检测SAN功能指标

采用心房调搏法测量造模前及造模后1 h的窦房传导时间（SACT） 、窦房结恢复时间（SNRT） 、校正窦房结恢复时间（SNRTc） 。比较各组模型兔造模前后SACT、SNRT和SNRTc。

（1） 实时荧光定量检测（RT-PCR） 检测HCN1、HCN2、HCN3、HCN4 mRNA表达：采用Trizol法提取SAN组织中的总RNA，采用紫外分光光度计法测定RNA的浓度。以RNA为模板进行逆转录获得cDNA并置于4℃保存，进行荧光定量PCR扩增，置于RT-PCR仪（CFX96型，美国bio-radBiorad公司） 中进行测定。设置反应条件：95 ℃，5 min预变性;95 ℃变性10 s，60 ℃ 退火35 s，65 ℃延伸 30 s，扩增35个循环。以β-action为内参，引物序列如下：HCN1：上游序列：5′-TGGTGGCTACAATGCCTTTA-3′，下游序列：5′-TTCCTCCGGGACCTCGTT-3′ ;HCN2：上游序列：5′-CGTTACCAGGGCAAGATGTTT-3′，下游序列：5′-GTTGTCCACGATCAGCGAAT-3′;HCN3：上游序列：5′-TCTCCGACACCTTCT。TTCTGC-3′，下游序列：5′-CCCACTGGTGTATGTAGCGG-3′;HCN4：上游序列：5′-GTACTCCTACGCGCTCTTCA-3′，下游序列：5′-GCTCTCCTCGTCGAACATCT-3′;β-action：上游序列： 5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游序列：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。采用 2-ΔΔCT 法对统计HCN1、HCN2、HCN3、HCN4 mRNA相对表达量。

（2） Western blot检测起搏相关蛋白：取左心室SAN区心肌组织，裂解以3000 r/min转速离心10 min，取上清液，提取心肌组织蛋白，经BCA法检测蛋白浓度;凝胶电泳后转膜;5 %脱脂奶粉封闭孵育2 h，添加相应的一抗和二抗，选择GAPDH作为内参，使用ECL法显示蛋白。

1.4 统计学处理

应用 SPSS 22.0 软件进行统计分析。所有实验数据均符合正态分布，计量资料用（均数±标准差）表示，t检验;计数资料采用[n（%） ]表示，χ2检验。检验水准为α = 0.05，以双侧P < 0.05时，说明该数据具有显著性统计学差异。

2 结果

2.1 SAN损伤模型兔SAN变化

与假手术组相比，甲醛湿敷组和甲醛滴注组可见SAN细胞出现明显肿胀，部分粒细胞浸润和胶原纤维组织增生。甲醛湿敷组和甲醛滴注组组织细胞形态学差异不明显（P > 0.05） 。

2.2 不同損伤模型兔SAN功能比较

三组兔造模前SNRT、SNRTc和SACT比较无明显差异。造模后，与假手术组相比，甲醛湿敷组和甲醛滴注组SNRT、SNRTc和SACT明显上升（P < 0.05） ，且甲醛湿敷组SNRT、SNRTc和SACT明显高于甲醛滴注组（P < 0.05） 。见表1。

2.3 不同损伤模型兔SAN区HCN1、HCN2、HCN3和HCN4mRNA表达

研究结果发现，甲醛湿敷组和甲醛滴注组主要以HCN4 mRNA表达为主，少量HCN1、HCN2表达，未检出HCN3 mRNA 表达。甲醛湿敷组和甲醛滴注组HCN4 mRNA分别为（0.86±0.09） 、（0.63±0.07） 明显低于假手术组HCN4 mRNA表达（1.02±0.01） ，且甲醛湿敷组HCN4 mRNA表达低于甲醛滴注组HCN4 mRNA表达（P < 0.05） 。

2.4 不同损伤模型兔SAN区HCN4蛋白表达

甲醛湿敷组和甲醛滴注组HCN4蛋白相对表达水平明显低于假手术组，且甲醛湿敷组HCN4蛋白相对表达水平低于甲醛滴注组HCN4蛋白相对表达水平（P < 0.05） 。见图1。

3 讨论

SAN呈非特异性退行性纤维变性，是导致病态窦房结综合征的重要因素[4]。在该病变过程中起搏细胞逐渐被纤维组取代，从而导致SAN起搏细胞的直接减少，其正常起搏功能逐渐减退[5]。这些起搏细胞拥有特殊的离子通道流的组合，当SAN受到损伤时，这些起搏细胞原有的功能会出现异常，导致严重的心动过缓、高度房室传导阻滞等心律失常的发生。

本研究结果显示，甲醛湿敷组和甲醛滴注组可见SAN细胞出现明显肿胀，可见部分粒细胞浸润和胶原纤维组织增生，但甲醛湿敷组和甲醛滴注组组织细胞形态学差异不明显，说明甲醛湿敷和甲醛滴注均可对兔SAN区造成一定的损伤。本研究结果还发现，与假手术组相比，甲醛湿敷组和甲醛滴注组SNRT、SNRTc和SACT明显上升，且甲醛湿敷组SNRT、SNRTc和SACT上升幅度明显大于甲醛滴注组。甲醛滴注法利用SAN损伤电图的特异性，角度新颖，同时对兔产生的创伤较小，但SAN电图测量困难，容易受到自身或外界其他因素影响，使得造模损伤程度无法控制。甲醛湿敷法虽然对兔创伤大，但便于控制模型的损伤程度。本研究结果显示，甲醛湿敷组SNRT、SNRTc和SACT下降幅度明显大于甲醛滴注法，分析其原因可能是因为心脏表面光滑，不易于甲醛吸附在心脏表面，导致SAN损伤程度不足造成，其具体原因需进一步研究分析。本研究分析不同建模方式对起搏相关离子通道功能的影响发现，甲醛湿敷组和甲醛滴注组均以HCN4表达为主，少见HCN1、HCN2表达，且甲醛湿敷组HCN4 mRNA和蛋白表达水平明显低于甲醛滴注组。HCN是一种环总超家族阳离子通道，主要存在于细胞膜上，其异常表达可能导致严重的SAN功能障碍[6]。既往研究显示[7]，SAN免疫组化染色显示HCN4表达位于结中央区，向周边逐渐减少，甲醛加压注射渗透法建立兔SAN组织损伤模型后，兔SAN组织HCN4蛋白表达有不同程度的下降。本研究结果说明，两种SAN损伤建模方式对HCN4通道均有影响，但甲醛湿敷组影响较大，可能与其对SAN造成的损伤程度有关。

综上所述，甲醛湿敷法建立兔SAN损伤模型优于甲醛滴注法。一个理想的制造病态窦房综合征模型试剂，首先必须能对作用区域的心肌细胞造成一定程度的损伤。其次，其作用范围及程度可控，不致使药液作用范围过大而损伤正常心肌组织。

参考文献

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