益母缩宫颗粒调节药物流产不全大鼠血管生成调节因子的实验观察

李品英，毛惠，黄正迎

（1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.西南医科大学附属中医医院 妇产科，四川 泸州 646000）

0 引言

药物流产主要是采用口服米非司酮和米索前列醇来终止妊娠，无痛人流术是在传统人流手术的基础上，结合丙泊酚及芬太尼使手术中的患者痛苦减少[1]。药物流产因其方法简便、价格低、创伤小，临床应用广泛，患者接受度高。但部分患者会出现流产不全，表现为阴道出血时间延长，出血量增多，易造成盆腔感染、月经紊乱、贫血等并发症[2]。减少药物流产后异常子宫出血是目前临床上需要不断摸索且需解决的问题。

益母缩宫颗粒为我院院内制剂，是由《傅青主女科》生化汤化裁而来，由当归、川芎、桃仁、炮姜、益母草、枳壳、蒲黄（生）七味中药组成,，临床常用于治疗产后、人工流产、上环等术后引起的阴道不规则出血。课题组前期研究发现益母缩宫颗粒能明显缩短药物流产后阴道流血时间、减少流血量、促进恶露排出、帮助子宫复旧等，有效减少药物流产后相关并发症[3-5]。目前关于益母缩宫颗粒对药物流产后子宫异常出血的作用机制尚不明确。本实验通过依照王晓东[6]造模法建立药物流产不全大鼠模型，探讨益母缩宫颗粒是否通过调控血管生成调节因子Ang-1、Ang-2、VEGF 的表达来减少药物流产后子宫异常出血，研究益母缩宫颗粒的作用规律，为本药的进一步研究提供参考。

1 材料与仪器

1.1 实验动物：

SPF 级别SD 大鼠，选用2 月龄健康雄性SD 大鼠25 只，体重（250±20）g，2 月龄健康雌性SD 大鼠60 只，体重（220±20）g。均由西南医科大学动物实验中心提供，许可证号SCXK（川）2018-17。均饲养于西南医科大学实验动物中心，许可证号SYXK（川）2018-065。

1.2 实验药物与试剂

益母缩宫颗粒（西南医科大学附属中医医院制剂室，规格：10g/袋，产品批号20191119）；米非司酮（华润紫竹药业有限公司，规格：25mg/片，产品批号432005041）；米索前列醇（华润紫竹药业有限公司，规格：0.2mg/片，产品批号43200304）；注射用苯巴比妥钠（上海上药新亚药业有限公司，规格：0.1g/瓶，产品批号190503）；缩宫素注射液(河南辅仁怀庆堂制药有限公司，规格：10IU/支，产品批号:21908013)；大鼠血管内皮细胞生长因子(VEGF)ELISA 试剂盒(货号：ZC-37412，规格：96 孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)，大鼠促血管生成素-1(Ang-1)ELISA 试剂盒(货号：ZC-37428，规格：96 孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)，大鼠促血管生成素-2(Ang-2)ELISA 试剂盒(货号：ZC-37429，规格：96 孔/盒，上海茁彩生物科技有限公司生产)。

1.3 主要仪器

计算机，型号，TFT185W80PS，冠捷显示科技有限公司生产；酶标仪，型号，SpectraMAXPlus384，美谷分子仪器有限公司生产；优普超纯水制造系统，型号，UPH-Ⅱ-10T，成都超纯科技有限公司生产；电子恒温水浴锅，型号DZKW-4，北京中兴伟业仪器有限公司生产；手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器，型号，SYQ-DSX-280B，上海申安医疗器械厂生产；移液枪，规格，1000μL、200μL、20μL、10μL、2μL，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司生产；枪头，规格，1000μL、200μL、20μL，美国Axygen 公司生产；EP 管，规格：1.5mL、0.2mL、100μL，美国Axygen 公司生产。

2 实验方法

2.1 药物剂量设计

益母缩宫颗粒，大鼠给药量为1.562g/kg·d，中剂量组3.125g/kg·d，高剂量组6.25g/kg·d；米非司酮，大鼠服药剂量为8.3mg/kg，将该药研磨成细粉后加入蒸馏水，灌胃前摇匀；米索前列醇，大鼠服药剂量为100μg/kg，将该药研磨成细粉后加入蒸馏水，灌胃前摇匀给药；以上药物灌胃时按体积给药：1mL/100g；缩宫素注射液，大鼠用药剂量为0.9U/kg/d。

2.2 造模

选择SPF 级成熟雌性大鼠60 只，雄性大鼠25只，适应性喂养1 周后，随机挑选10 只未合笼雌性大鼠作为空白组（E 组）。依照王晓东造模法将剩下的50 只雌性SD 大鼠与25 只雄性SD 大鼠按照2：1 比例于每日18 时合笼，次日晨8 时检查阴栓或阴道涂片，在阴栓或涂片上发现精子者定为妊娠第一天d1，若未受孕，则雌鼠继续保留，待下次合笼受孕。将成功交配大鼠于妊娠d7 灌胃米非司酮(8.3mg/kg，8 时)和米索前列醇(100ug/kg，18 时)，同时在阴道内置入定量消毒棉球一个，观察阴道出血情况，d8 清晨8 时检查大鼠阴道消毒棉球，见血迹提示造模成功。

本次实验共造模成功48 只雌鼠，将造模成功SD大鼠随机分为5 组，即模型组（D 组10 只）、益母缩宫颗粒低剂量组（A 组10 只）、益母缩宫颗粒中剂量组（B 组9 只）、益母缩宫颗粒高剂量组（C 组9 只）、缩宫素对照组（F 组10 只）。

益母缩宫颗粒实验组于妊娠D8 开始每日按高、中、低浓度益母缩宫颗粒灌胃，连续灌胃7 天，每天1 次；模型组及空白组大鼠于妊娠D8 开始每日灌喂动物实验中心饮用水，连续灌胃7 天，每天1 次；缩宫素对照组于妊娠D8 开始肌肉注射缩宫素，连续注射3 天，每天1 次。

2.3 取材

各组大鼠于妊娠D15 早晨8:00 行全身麻醉（注射用苯巴比妥钠50mg/kg 腹腔注射）。待麻醉满意后，以大鼠下腹部正中为切口，沿腹白线纵行切开2～3 厘米；逐层切开皮肤、皮下组织，钝性分离肌肉，暴露腹腔，找到腹主动脉，迅速取血，离心机分离血清，将血清存放于-80℃冰箱备用。

2.4 血管生成调节因子检测

采用ELISA 法检测大鼠血清中血管内皮细胞生长因子（VEGF）、促血管生成素-1(Ang-1) 和促血管生成素-2(Ang-2)水平。

2.5 统计分析

实验数据资料用SPSS 23.0 进行分析，VEGF、Ang-1 和 Ang-2 数据分布呈正态分布且方差齐，用“”表示，统计方法使用单因素方差分析，P<0.05 则认为差异具备统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠血清中ANG-1 浓度的变化

如表1 统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠血清中ANG-1 浓度明显降低，差异极显著（P<0.01）。与模型组相比，益母缩宫颗粒高剂量组、缩宫素组大鼠血清中ANG-1 浓度升高，差异显著（P<0.05）；其余各大鼠血清中ANG-1 浓度无明显差异，不具备统计学意义（P>0.05）。

表1 各组大鼠血清中ANG-1 浓度的变化（）

表1 各组大鼠血清中ANG-1 浓度的变化（）

注：模型组与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01；其余组与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 各组大鼠血清中ANG-2 浓度的变化

如表2 统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠血清中ANG-2 浓度明显降低，差异极显著（P<0.01）。与模型组相比，缩宫素组、益母缩宫颗粒高剂量组大鼠血清中ANG-2 浓度升高，差异显著（P<0.05）；其余各大鼠血清中ANG-2 浓度无明显差异，不具备统计学意义（P>0.05）。

表2 各组大鼠血清中ANG-2 浓度的变化（）

表2 各组大鼠血清中ANG-2 浓度的变化（）

注：模型组与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01；其余组与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

3.3 各组大鼠血清中VEGF 浓度的变化

如表3 统计结果显示，与空白组相比，模型组大鼠血清中VEGF浓度明显降低，差异极显著（P<0.01）。与模型组相比，缩宫素组、益母缩宫颗粒高剂量组大鼠血清中VEGF 浓度升高，差异显著（P<0.05）；其余各大鼠血清中VEGF 浓度无明显差异，不具备统计学意义（P>0.05）。

表3 各组大鼠血清中VEGF 浓度的变化（）

表3 各组大鼠血清中VEGF 浓度的变化（）

注：模型组与空白组相比，*P<0.05，**P<0.01；其余组与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

4 讨论

血管内皮细胞生长因子（VEGF）和血管内皮细胞生长因子受体-2（VEGFR2）所构成的信号通路是作用最强的正性调控血管生成的信号通路之一，对血管新生的整个过程发挥了不可替代的调节作用[7]。血管内皮细胞是产生VEGF 的主要细胞。VEGF 的主要功能受体是VEGFR-2，VEGF 通过与血管内皮细胞膜上VEGFR-2 结合来引发细胞内的信号转导，进一步对下游的信号网络通路发挥激活作用，最终促使血管内皮细胞生长、分化、迁移，修复损伤的血管内皮细胞，诱导新生血管生成，维持血管壁的通透性。

血管生成素-1(Ang-1)、血管生成素-2(Ang-2)及其受体Tie-2，是另一条新的血管生成信号转导通路，在人类血管形成中发挥着非常重要的作用[8]。Ang(血管生成素)具有调节血管稳定和血管新生的功能，有Ang-1 和Ang-2 两个亚型，Tie-2 是其共同受体。Ang-l 和Tie-2 结合后促使Tie2 磷酸，Tie2磷酸化的内皮细胞可以吸引血管平滑肌细胞、周细胞等聚集，从而促使内皮细胞形成完整的血管腔壁，促进血管形成。还可以通过细胞与细胞、细胞与基质等相互作用维持血管结构的稳定[8]。Ang-2 与Tie-2 结合能竞争性拮抗Ang-1 促使Tie-2 磷酸化的作用，抑制血管的稳定性，增加内皮细胞对VEGF 的敏感性，从而增加VEGF 血管新生作用[9]。

药物流产后子宫异常出血属传统医学的“产后恶露不绝”“胞衣残留”等范围，中医证型以“多虚多瘀”为特点，病机以“瘀血阻滞”为中心。旧血不去，新血不生，中医治疗主要以活血化瘀为主。益母缩宫颗粒具有活血化瘀，促进宫缩的作用。前期研究证实益母缩宫颗粒可以促进药物流产不全大鼠子宫复旧，促进子宫平滑肌收缩，缩短阴道出血时间[10]。本研究显示，益母缩宫颗粒高剂量组能显著升高模型大鼠血清中VEGF、Ang-1、Ang-2 的含量，其可能通过此途径调节VEGF、Ang-1、Ang-2 的表达来促进子宫内膜创面新生血管形成，促进子宫内膜修复，从而减少模型大鼠出血时间及出血量。