不同日龄鸡肺脏中MHC-Ⅱ+细胞的分布规律

张英楠，张桂山，徐 晶，杨树宝,3,*

(1.吉林医药学院，吉林 吉林 132013；2.长春科技学院；3.吉林农业大学 动物科技学院)

目前，家禽的呼吸道疾病如禽流感和新城疫等给家禽养殖业带来了巨大的损失，而肺脏又是家禽许多病毒性和细菌性疾病的主要靶器官，病原体会通过肺呼吸系统黏膜表面进入宿主，然后进一步散布到其他器官中。因此，动物的健康在很大程度上取决于是否能够成功控制病原在肺脏组织尤其是肺脏支气管黏膜表面的入侵和复制。抗原呈递细胞(Antigen-presenting cells,APC)是指能够摄取、加工处理抗原，并将处理过的抗原呈递给T、B淋巴细胞的一类免疫细胞。研究表明,肺脏中的APC在肺免疫性疾病,如哮喘、特发性纤维化及病毒感染等疾病中具有重要的免疫学意义。主要组织相容性复合体II类分子(major histocompatibility complex-II，MHC-II)是免疫系统的重要组成部分，主要表达在抗原呈递细胞，如树突状细胞和巨噬细胞上，负责抗原递呈，在自我识别的机体系统中使特异性T淋巴细胞检测到外来抗原。因此，MHC-II分子是抗原呈递细胞膜表面的主要细胞识别标志。

孵化期间由蛋壳气孔过滤后的气体是禽类的氧气供应源。出壳之后，雏禽开始接触外界空气，并逐渐适应外界环境，同时其呼吸道结构和功能也得到发育和建立。出壳初期为了适应外界环境，鸡的肺脏也经历着相应的快速变化。伴随着肺脏结构和功能的一系列转变，肺脏的免疫功能也应发生着相应的变化，其中抗原呈递细胞的发育及呈递功能的发生至关重要，将决定是否能够及时并有效的产生免疫应答。因此本研究采用免疫组织化学方法研究从鸡胚到出壳后的不同生长发育阶段，肺脏中MHC-II+细胞的发育情况以及定位分布变化，从而反映发育时期鸡肺脏的免疫状态变化，为进一步研究家禽肺脏的免疫机制奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验动物

200个海兰褐SPF种蛋，购自吉林卓越生物科技有限公司。种蛋进行常规孵化，雏鸡进行常规饲养。

1.2 主要试剂及用具

冰冻切片用OCT组织包埋液购自美国Sakura公司；小鼠抗鸡MHC-II单克隆抗体购自美国Southern Biotechnology公司；Ultra Sensitive SP超敏试剂盒kit 9901购自福州迈新公司。

依爱EIF/C.DME3456 孵化机/出雏机(广东依爱孵化机厂生产)，Leica CM1850 冰冻切片机(德国Leica公司生产)，Olympus CX41 显微镜(日本Olympus公司生产)，Pixera pro150ES图像采集器(美国Pixera公司生产)。

1.3 试验设计

200个海兰褐SPF种蛋进行孵化，鸡出壳后置于动物室中常规饲养。分别选择未经过疫苗免疫的11、13、15、18、20日胚龄鸡胚，1、4、7、14、21、35、56和90日龄的雏鸡，每个时期取3只鸡胚或雏鸡的肺脏组织。将肺脏组织制成冰冻切片，片厚5 μm，于-80 ℃保存备用。

1.4 免疫组织化学染色程序

每张切片滴加30 ml/L过氧化氢，室温下孵育10 min；PBS洗3次，每次3 min；除去PBS，每张切片分别滴加小鼠抗鸡MHC-II单克隆抗体工作液，37 ℃孵育1 h；PBS洗3次，每次3 min；每张切片滴加聚合物增强剂(试剂A)，室温下孵育20 min；PBS洗3次，每次3 min；每张切片加酶标抗鼠/兔聚合物(试剂B)，室温下孵育30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB显色；苏木精复染；自来水冲洗返蓝；梯度酒精脱水；二甲苯透明；中性树脂封片；照相。

1.5 图像分析及统计学处理

应用Image-pro plus6.0图像分析软件测定肺脏中单位视野内阳性细胞面积。每张切片测3个视野，取平均值。应用SPSSl8.0软件对不同日龄的同一阳性细胞进行单因素方差分析。

2 结果

2.1 胚胎期肺脏中MHC-Ⅱ+细胞的分布规律

13日胚龄，MHC-Ⅱ+细胞已经出现在肺脏中，由于此时肺脏的组织结构仍处于发育早期，很难辨别MHC-Ⅱ+细胞分布的准确位置，似乎是出现在大的肺内导管-初级支气管或次级支气管周围(图1A)。

15日胚龄，各种免疫细胞中也只有MHC-Ⅱ+细胞存在，而且数量明显增多，而且分布范围变广，较多地分布于由三级支气管管壁内陷所刚刚形成的肺房的房间隔中(图1B)。

18日胚龄与20日胚龄的发育状况相近，分布在房间隔上的MHC-Ⅱ+细胞继续增多(图1C)。

2.2 出壳后初期肺脏中MHC-Ⅱ+细胞的分布规律

1日龄时，MHC-Ⅱ+细胞数量继续增多，MHC-Ⅱ+细胞除分布在房间隔上外，还在小叶间结缔组织中有分布(图1D)。

4日龄时，通过免疫组织化学染色可见，在初级支气管与次级支气管交汇处有淋巴细胞的聚集物，即形成了明显的支气管相关性淋巴组织(BALT)。从此时起，肺脏内的淋巴细胞就以两种形式存在，一是集合性淋巴组织—BALT，另外就是散布在肺小叶中的弥散性淋巴组织。此时BALT中的大多数细胞都表达MHC-Ⅱ，成为主要的细胞群体(图1E)。除了形成BALT外，肺脏肺小叶中的各种免疫细胞的数量也较之前日龄明显增加，MHC-Ⅱ+细胞开始分布在三级支气管气道内壁中(图1F)。

7日龄时，BALT更为发达，MHC-Ⅱ+细胞在房间隔和小叶间结缔组织中也有大量分布(图1G)。

14日龄时，呼吸性毛细管管壁上的出现较多的MHC-Ⅱ+细胞(图1H)。

2.3 21-90日龄肺脏中MHC-Ⅱ+细胞的分布规律

21日龄时，BALT特别发达，其中MHC-Ⅱ+细胞数量显著增加(图2)，而且除了BALT中之外，MHC-Ⅱ+细胞已遍布全肺(图1I)。

35日龄时，无论是BALT中，还是肺小叶中MHC-Ⅱ+细胞的数量都持续增加(图1J，图2)。

56和90日龄时，MHC-Ⅱ+细胞的分布部位和数量与35日龄时基本一致，无明显变化(图1K，图1L，图2)。

图1 胚胎期和出壳后各时期鸡肺脏中MHC-Ⅱ+细胞的动态变化

图2 BALT中MHC-Ⅱ+ 细胞的数量变化

3 讨论

在禽类养殖中，呼吸系统的疾病是影响养殖的疾病之一，给养殖业也带来了很大的经济损失。目前，对黏膜表面进行疫苗接种是阻止致病菌的入侵机体的主要方法，如滴鼻点眼和喷雾等接种方法。为了研制适合鸡使用且可以提供有效免疫保护的黏膜新型疫苗，就需要对鸡肺脏相关免疫系统的结构和功能的有综合的了解。但目前还缺乏有关鸡肺相关免疫系统的知识。

抗原呈递细胞尤其是树突状细胞是肺脏免疫微环境的重要组成部分和免疫前哨细胞，它与其它免疫活性细胞共同构成了肺脏的免疫屏障，具有免疫监视及诱导免疫应答反应的作用，同时也是特异性和非特异性免疫反应最重要的调节细胞。研究表明，大鼠肺脏树突状细胞在胚胎及出生时处于发育不完善状态，包括数量偏少，MHC-II 分子表达过低，处理抗原提呈功能较弱等，与成年鼠的水平存在差距，这可能是幼鼠呼吸道抵抗力低下的重要因素。本研究发现，13日胚龄时，MHC-Ⅱ+细胞已经较早地出现在肺脏中，由于此时肺脏的组织结构仍处于发育早期，很难辨别MHC-Ⅱ+细胞分布的准确位置，似乎是出现在大的肺内导管-初级支气管或次级支气管周围。随后胚胎期各日龄以及出壳后1日龄，MHC-Ⅱ+细胞数量随有所增加，但并不显著，这也在一定程度上证明鸡在胚胎期以及刚出壳时由于缺少抗原呈递细胞而导致呼吸道免疫力低下，容易受到病原菌的侵扰。