陕西西安蛋鸡禽肝炎脾大综合征HEV基因3型病毒分离与鉴定

张靖飞，张 园2，张靖维3，冯 鹏，石龙飞，王 新

(1.西安市动物疫病预防控制中心，陕西 西安 710061；2.西北农林科技大学动物医学院；3.青海省都兰县畜牧兽医站)

禽戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)可引起鸡大肝大脾病、肝炎脾大综合征和产蛋率下降，危害全世界养禽业的健康发展。该病会导致蛋鸡和肉种鸡的死淘率升高(1 %～4 %)、产蛋率下降(20 %～40 %)以及种蛋孵化率降低(10 %～30 %)。此外，禽HEV感染会使鸡群处于亚健康状态，当气候和饲料等外界环境改变或与其它病原混合感染时，极有可能导致鸡群爆发鸡大肝大脾病、肝炎脾大综合征和产蛋率下降。目前，该病毒感染在许多国家或地区的鸡群中均有报道。

1997年，杨德吉等首先通过血清学证实了禽HEV感染存在于我国鸡群中。2010年，我国第一株禽HEV被分离鉴定。流行病学调查发现，禽HEV感染是我国鸡群暴发肝脾肿大的主要病因。近年来，禽HEV与其它病原混合感染导致的肝破裂出血综合征也给我国蛋鸡和种鸡养殖业造成了严重的经济损失。2014～2015年，陕西省部分蛋鸡场爆发了禽HEV感染引起的产蛋率下降的疫情，给养鸡场带来了严重的经济损失。随后，通过改善鸡场的生物安防，部分疫情得到了有效控制。

2019年7月，陕西西安市某蛋鸡场(存栏量为32 000只)的一栋鸡舍(海兰褐商品蛋鸡7 500只)，鸡只在42周龄时出现产蛋率下降，47周龄时产蛋率下降达到最大(30 %)，死淘率升高5 %左右。临床剖检发现部分死亡鸡只肝脏出血、肿大和坏死(图1)。依据临床表现和剖检病变，初步怀疑该疫情可能是由禽HEV感染引起的鸡大肝大脾病。为了进一步确诊，本研究从发病的蛋鸡场采集了36份血清、13份胆汁以及粪便、肝脏和脾脏各11份，然后利用间接ELISA和巢式RT-PCR分别对血清中的抗禽HEV抗体和粪便等病料中的禽HEV RNA进行了实验室检测。

图1 部分死亡及时剖检后出现肝脏肿大和坏死

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 总RNA提取试剂RNAiso Plus和T载体连接试剂盒pMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司；Transcript反转录酶，Transtaq High Fidelity DNA聚合酶，EasyPure Quick Gel Extraction试剂盒等常规分子生物学试剂购自北京全式金生物技术有限公司。其它常规的有机和无机试剂为国产分析纯。

1.1.2 样品的来源 从发病鸡舍中随机挑选32只鸡，翅静脉采集血液(32份)；剖检死亡鸡13只，取剖检鸡只的胆汁(13份)，粪便(11份)，肝脏(11份)和脾脏(11份)。

1.2 方法

1.2.1 样品的处理 将采集的血液样品首先37 ℃放置 1 h，4 ℃过夜后，3 000 r/min离心10 min，析出血清用于禽HEV抗体检测。将采集的粪便和胆汁样品首先用无菌0.1 M PBS(pH=7.2)按照质量体积比制成10 %悬浮液，然后3 500 r/min离心10 min，上清液用于禽HEV RNA的检测。采集的肝脏和脾脏样品首先用组织研磨机研磨后，反复冻融3次，3 500 r/min离心10 min，取上清用于禽HEV RNA的检测。

1.2.2 血清中抗禽HEV抗体检测 间接ELISA检测采集的鸡血清中抗禽HEV抗体，以原核表达纯化的截短的禽HEV ORF2蛋白为包被抗原，2.5 %的脱脂奶粉封闭，利用洗涤液将鸡血清样品按1∶50稀释，室温孵育1 h后，加入100μL 1∶6 000稀释的HRP标记的羊抗鸡二抗，最后加入TMB显色，浓硫酸终止反应后，自动酶标仪450 nm读数。

1.2.3 粪便、胆汁、肝脏和脾脏中禽HEV的RNA检测 参考Sun等的方法，进行样品中禽HEV RNA的检测。首先合成扩增禽HEV ORF2基因的部分序列的巢式PCR引物，外侧引物为ORF2/F-1/SD：5'-TCGCCT(C)GGTAAT(C)ACA(T)AATGC-3'，ORF2/R-1/SD：5'-GCGTTC(G)CCG(C)ACAGGT(C)CGGCC-3'；内侧引物为ORF2/F-2/SD：5'-ACA(T)AATGCT(C)AGGGTCACCCG-3'，ORF2/R-2/SD：5'-ATGTACTGA(G)CCA(G)CTG(C)GCCGC-3'，其扩增的目的片段的大小分别为278 bp和242 bp。按照RNAiso Plus试剂的操作说明书，取200 μL已处理的粪便、胆汁，肝脏和脾脏的上清液进行总RNA的提取。然后以提取的RNA为模板，按照Transcript反转录酶的使用说明书，以oligo dT为反转录引物，合成cDNA。以cDNA为模板，按照Transtaq High Fidelity DNA聚合酶说明书进行巢式PCR扩增。最后，取5 μL第二轮PCR产物于0.8 %的琼脂糖凝胶电泳观察结果。

1.2.4 禽HEV ORF2基因部分序列的测定与分析 按照EasyPureQuickGelExtraction试剂盒的说明书对扩增的阳性PCR产物进行胶回收，然后将回收产物与pMD18-T载体进行TA连接，将连接产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

利用DNA Star软件将测序获得序列与GenBank上禽HEV的参考序列进行同源性和进化树分析。所用参考序列的GenBank登录号为KP221201、GQ398042、AY870827、FM872317、FM872312、AY870829、EU919193及FM872314。

2 结果

2.1 禽HEV抗体检测结果

依据建立的禽HEV抗体间接ELISA检测方法阴性和阳性血清的判定值(OD 450 nm>0.298为阳性，反之为阴性)判定值0.298，结果发现检测的32份鸡血清中28份为抗禽HEV抗体阳性，阳性率为87.5 %，其中6份鸡血清的OD 450 nm>1.0(图2)。

图2 间接ELISA检测32份鸡血清中抗禽HEV抗体结果

2.2 禽HEV的RNA检测结果

利用巢式PCR检测肝脏，脾脏，胆汁和粪便共46份样品中禽HEV核酸，琼脂糖凝胶电泳结果显示，11份肝脏组织样品中，5份出现的242 bp的目的条带；11份脾脏样品中，3份为阳性；13份胆汁样品中，6份为阳性；11份粪便样品中，3份为阳性(图3)。结果统计发现，胆汁样品中阳性率为46.15 %，检出率最高；肝脏样品中阳性率为45.45 %，检出率次之；粪便和脾脏样品中阳性率均为27.27 %(表1)。

M.DNA 标准 DL 15 000；1-11：肝脏样品；12-22：脾脏样品；23-35：胆汁样品；36-46：粪便样品

表1 不同样品禽HEV核酸检测的统计结果

2.3 序列分析

将获得的17份阳性样品的PCR产物胶回收与pMD18-T载体连接后测序。测序结果发现所获得17个序列相互之间的同源性为99 %～100 %，为同一禽HEV分离株，将该分离株命名为SX-XA-1。将该序列与GenBank上已知的禽HEV序列同源性比较发现，其与中国其它地区的禽HEV分离株的同源在在93 %～96 %之间，与基因3型分离株的同源性在93 %～97 %之间，与基因1型分离株同源性在80 %～83 %，2型为77 %～80 %，4型为81 %～86 %(表2)。

表2 扩增获得的禽HEV ORF2部分基因序列与国内其它地区以及其它基因型分离株的同源性比较分析

利用DNA Star软件包里的Clustal W 程序构建不同禽HEV分离株的进化树，结果显示本研究分离的陕西西安禽HEV分离株SX-XA-1与我国其他省份地区及欧洲和美国部分分离株在同一进化分支上，同属于禽HEV基因3型(图4)。

图4 不同禽HEV分离株ORF2部分基因序列构建的进化树

3 讨论

禽HEV感染一方面仅引起鸡只的亚临床感染，但当外界因素(环境、饲料等)改变或与其它病原混合感染时会引起鸡只发病；另一方面高剂量禽HEV单独感染也可引起蛋鸡的产蛋率下降。本次疫情发病的鸡场已断断续续持续发病2个月，鸡只在47周龄时产蛋量下降率达到最大约30 %，同时伴随鸡只死淘率上升(5 %左右)，通过抗生素治疗，发现效果不佳。对病死鸡剖检后发现部分鸡只出现肝脏肿大、出血。依据临床表现和剖检病变，初步怀疑为禽HEV感染导致。随后我们对发病鸡进行血清学和病原学检测，间接ELISA抗体和巢式PCR 检测结果证实该鸡场存在禽HEV感染。但是，临床上禽HEV单独感染通常仅会引起鸡只的亚临床感染，因此，我们推测该疫情可能还有其他因素共同参与导致的，通过对鸡场的问询和饲料使用情况调查后，此次疫情诊断为由禽HEV感染和饲料(霉变)改变共同引起的。

由于禽HEV体外培养体系的缺乏，目前对该病的诊断主要通过血清中抗体检测和组织样品中的禽HEV RNA检测。其中抗体检测主要是通过原核表达纯化的禽HEV ORF2蛋白为包被抗原的间接ELISA方法进行检测，目前已有基因2型和3型禽HEV衣壳蛋白包被抗原的间接ELISA方法被报道，并且被广泛应用于血清中禽HEV抗体的检测。而禽HEV的RNA检测，主要是通过针对禽HEV ORF1和ORF2基因设计引物进行检测，目前针对ORF2基因保守区设计的引物被广泛使用。本研究通过已建立的禽HEV抗体检测的间接ELISA方法证实鸡群中存在禽HEV抗体，其次通过针对扩增ORF2基因的巢式RT-PCR方法证实了死亡鸡只中存在禽HEV核酸，血清学和病原学共同证实了禽HEV感染在该鸡场中的存在。

禽HEV感染和禽白血病等疾病临床症状表现相似，但是可以通过实验室检测进行鉴别诊断。本次疫情剖检鸡只肝脏肿大，但未出现大小不一的结节状或块状肿瘤，同时对鸡场马立克，J亚群禽白血病的实验室检测结果也均为阴性；此外对肝脏进行细菌分离，也未分到任何致病性细菌。因此，综合上述检测结果，该疫情排除了其它疾病感染的可能性。

目前认为粪-口途径的水平传播是禽HEV的主要传播途径。目前尚无针对该病的特效疫苗和治疗药物。该病的防控主要是通过检测鸡只，淘汰禽HEV核酸阳性鸡只，然后及时进行鸡舍的消毒，并对鸡粪进行及时处理，加强饲养管理和生物安全防控措施，减少鸡群应激，增强鸡群抵抗力，从而防控该病在鸡群中的持续发生。