乌梅总黄酮对MPP+诱导SH-SY5Y 细胞损伤的保护作用及机制

王春玲，文晓东，罗 宁，蒋媛静，江 颖，曾 振

（1.广西中医药大学，广西 南宁530200；2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁530011）

帕金森病（parkinson’s disease，PD）是目前仅次于阿尔茨海默病（alzheimer’s disease，AD）的全球第二大神经退行性疾病，严重影响广大中老年人身心健康。PD 的发病机制复杂，其中线粒体功能障碍是PD 重要的病理机制，大量研究表明，线粒体介导的细胞凋亡过程与PD 中黑质致密部多巴胺能神经元细胞的缺失密切相关［1］。因此，靶向线粒体，纠正线粒体功能障碍，抑制神经元细胞凋亡，促进神经细胞的修复和存活可能是预防和治疗PD 的有效策略，同时也是当前研究和开发防治PD 药物的热点之一［2］。

乌梅总黄酮（fructus mume total flavone，FMF）是传统中药乌梅的主要功效成分，具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗衰老、抗癌及调节凋亡等药理作用［3］。本项目组前期研究结果显示，FMF 可能通过修复线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ～Ⅳ的活性水平，提高ND1、ND4 mRNA 及其蛋白的表达，改善线粒体功能，有效地抑制黑质多巴胺能神经元凋亡［4］。本研究排除体内因素干扰，进一步研究FMF 对PD模型细胞凋亡的影响，拟通过MPP+诱导SH-SY5Y细胞建立PD 细胞模型，探讨FMF 对MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞损伤是否具有保护作用以及可能的机制，为FMF 防治PD 提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞购自中国科学院上海细胞库。经广西中医药大学科学实验中心细胞室传代培养、冻存。FMF 对照品，纯度>99%，购自中国药品生物制品鉴定所，批号：110820-200216；DMEM 培养基，购自美国Genmed 公司；二甲基亚砜（DMSO），购自美国Sigma 公司；DAPI 染色试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，An‐nexin-APC/PI 双染细胞凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒均购自南京凯基生物科技发展有限公司。BCA 蛋白定量试剂盒（BCA Protein As‐say Kit）购自美国CST 公司。兔抗Bcl-2 一抗、兔抗Bax 一抗、兔抗Caspase-3 一抗均购自美国Santa Cruz 公司。羊抗兔二抗购自美国Abcam 公司。

1.2 仪器与设备

CO2恒温培养箱（日本三洋公司）、超净工作台（苏州净化设备有限公司）、倒置相差显微镜（CKX31 型，Olympus，日 本）、倒 置 荧 光 显 微 镜（IX73 型，Olympus，日 本）、台 式 高 速 离 心 机（TG20M 型，上海安亭科学仪器厂）、流式细胞仪（Beckman，美国）、全自动荧光酶标仪（Thermofish‐er，美国）。

1.3 SH-SY5Y 细胞的复苏与培养［5］

配置含10%胎牛血清的DMEM 培养液，置于37 ℃的水浴锅中预热10 min。从液氮罐中取出SHSY5Y 细胞冻存管，迅速置于37 ℃水浴锅中至完全融解。在超净工作台中将冻存管内的液体移至离心管中，混匀，1 000 r/min 离心5 min，弃上清液，后加入1 mL DMEM 完全培养液重悬。将细胞悬液接种于无菌培养瓶内，放置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中培养。

1.4 SH-SY5Y 细胞模型的建立和分组给药

采用MPP+诱导SH-SY5Y 细胞发生凋亡，设置不同浓度MPP+分别作用24、48、72 h，CCK-8 法检测MPP＋对细胞的毒性，确定MPP＋浓度及作用时间，最终确定250 μmol/L MPP+作用72 h 为建模浓度和时间。细胞实验分为正常对照组（NC 组，DMSO）、模 型 组（250 μmol/L MPP＋）、FMF 低（250 μmol/L MPP＋+ 10 μmol/L FMF）、中（250 μm ol/L M P P＋+ 50 μm ol/L F M F）和 高（250 μm ol/L MPP＋+100 μmol/L FMF）剂量组。

1.5 DAPI 染色法观察不同浓度的FMF 对MPP＋诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡的影响

DAPI（化学名4，6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐），是一种荧光染料，通过与凋亡细胞核结合而发出蓝色荧光，用于鉴别凋亡细胞［6］。

取对数生长期的SH-SY5Y 细胞按7×104/mL的密度接种于24 孔培养板，以不同处理方式作用，PBS 洗3 次，4%多聚甲醛固定10 min，PBS 洗后加入DAPI 染液（浓度为10 μg/mL）37 ℃避光孵育15～20 min，弃染色液，PBS 冲洗后，荧光显微镜下观察细胞形态、拍照。

1.6 Annexin-FITC/PI 双染法检测不同浓度的FMF 对MPP＋诱导的SH-SY5Y 细胞凋亡的影响

参照文献［7］，按照Annexin-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书，0.25% 胰蛋白酶消化细胞，1 000 r/m in 离心5 min，弃上清液，后用预冷的PBS洗2 次，加结合缓冲液300 μL 反复吹打使细胞混合均匀，调整细胞浓度为1×106个/mL，后加入5 μL Annexin-VFITC 和10 μL PI，混匀，2～8 ℃静置20 min，流式细胞仪检测不同处理组细胞凋亡率。

1.7 线粒体膜电位测定［8］

0.25%胰酶消化后收集所有细胞，再将细胞吹打均匀，制成单细胞悬液，PBS 调整细胞浓度至1×106个/mL，加入KBHB 缓冲液配制的罗丹明123 溶液，流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位平均荧光强度值。

1.8 蛋白质印迹法（Western Blot）检测Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白的表达

参照文献［9］，按照BCA 试剂盒说明书测定蛋白浓度。每组取100 μg 蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。电泳结束后，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）后，将PVDF 膜浸于含5%脱脂奶粉的等渗缓冲盐溶液（TBST）中封闭1 h。分别加入Bcl-2（1∶400）或Bax（1∶500）或Caspase-3 抗体（1∶600），4 ℃孵育过夜后室温摇床孵育2 h；一抗孵育结束后用TBS-T 漂洗蛋白印迹膜3 次，每次5 min，加入辣根过氧化酶标记羊抗兔二抗（1∶2 000），室温孵育2 h，后以TBST漂洗3 次，每次5 min。最后以增强化学发光法（ECL）显影，β-actin 作为内参，用Image J 软件分析条带灰度值。

1.9 统计学处理

采用SPSS 22.0 软件进行统计分析，数据用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FMF 对MPP＋诱导SH-SY5Y 细胞凋亡形态的影响

DAPI 荧光染色结果表明：正常对照组细胞边缘清晰，染色均匀（图1A）；MPP+诱导损伤的SHSY5Y 细胞可出现明显的凋亡细胞特征性改变，表现为大部分细胞胞体缩小，胞质浓缩，细胞核体积缩小，细胞碎裂，出现典型的凋亡小体（图1B）；而10、50、100 μmol/L FMF 可显著抑制MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞形态学改变，减少凋亡细胞数（图1C-E），且呈浓度依赖性。

图1 DAPI 染色观察FMF 对SH-SY5Y 细胞形态学的影响（×400）Fig 1 Effect of FMF on the morphology of SH-SY5Y cells detected by DAPI staining（×400）

2.2 FMF对MPP+诱导SH-SY5Y 细胞凋亡率的影响

各组SH-SY5Y 细胞凋亡率比较，差异有统计学意义（F=142.737，P<0.01）。与正常对照组相比，模型组细胞凋亡率显著增加，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组相比，分别给予不同浓度的FMF（10、50、100 μmol/L）处理后，SH-SY5Y 细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义（P 均<0.01），表明FMF 对MPP+诱导损伤的SH-SY5Y 细胞具有浓度依赖性保护作用。见表1。

表1 FMF 对SH-SY5Y 细胞凋亡率的影响（n=6，±s）Tab1 Effect of FMF on the apoptosis rate of SH-SY5Y cells（n=6，±s）

表1 FMF 对SH-SY5Y 细胞凋亡率的影响（n=6，±s）Tab1 Effect of FMF on the apoptosis rate of SH-SY5Y cells（n=6，±s）

组别正常对照组模型组FMF 低剂量组FMF 中剂量组FMF 高剂量组凋亡率（%）8.18±0.99 37.65±3.92*28.87±1.86Δ 21.23±2.16Δ 17.73±1.33Δ浓度(μmol/L)0 250 10 50 100

2.3 FMF 对MPP+诱导SH-SY5Y 细胞线粒体膜电位（ΔΨm）的影响

各组ΔΨm 比较，差异有统计学意义（F=132.384，P<0.01）。与正常对照组相比，模型组ΔΨm 显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），提示MPP+处理细胞72 h 后线粒体膜电位发生了去极化。与模型组相比，分别给予不同浓度的FMF 预处理后ΔΨm 均有下降趋势，其中FMF 中、高剂量组和模型组比较，差异有统计学意义（P 均<0.01），FMF 低剂量组与模型组比较差异无统计学意义（P=0.312）。见表2。

表2 FMF 对SH-SY5Y 细胞ΔΨm 的影响（n=6，±s）Tab 2 Effect of FMF on the ΔΨm of SH-SY5Y cells（n=6，±s）

表2 FMF 对SH-SY5Y 细胞ΔΨm 的影响（n=6，±s）Tab 2 Effect of FMF on the ΔΨm of SH-SY5Y cells（n=6，±s）

注：与正常对照组相比，*P<0.01；与模型组相比，ΔP<0.01。

组别正常对照组模型组FMF 低剂量组FMF 中剂量组FMF 高剂量组浓度(μmol/L)0 250 10 50 100 ΔΨm（%）1.89±0.51 11.58±1.28*10.37±1.26 8.25±0.86Δ 5.96±0.69Δ

2.4 FMF 对MPP+ 诱 导SH-SY5Y 细 胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达的影响

各组Bcl-2 蛋白表达水平结果显示：多组间比较，差异有统计学意义（F=214.342，P<0.01）。与正常对照组相比，模型组B c l-2 蛋白表达水平明显降低（P<0.01），与模型组相比，FMF（10、50、100 μmol/L）Bcl-2 蛋白表达水平随药物浓度的增加逐渐升高，其中FMF 中、高剂量组升高明显，和模型组比较差异有统计学意义（P 均<0.01），低剂量组和模型组相比差异无统计学意义（P=0.080）。

各组Bax 蛋白表达水平比较结果显示，各组间差异有统计学意义（F=134.542，P<0.01）。与正常对照组相比，模型组Bax 蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）。FMF（10、50、100 μmol/L）组蛋白Bax表达水平随药物浓度的增加逐渐减少，且与模型组相比，差异均有统计学意义（P 均<0.01）。

各组Bcl-2/Bax 比值比较结果显示，表明各组间差异有统计学意义（F=1 944.449，P<0.01）。与正常对照组相比，模型组Bcl-2/Bax 比值明显降低（P<0.01），与模型组相比，FMF（10、50、100 μmol/L）3个浓度实验组的Bcl-2/Bax 比值与模型组相比显著升高，差异均有统计学意义（P 均<0.01）。

各组Caspase-3 蛋白表达水平比较结果显示，各组间差异显著（F=268.902，P<0.01）。与正常对照组相比，模型组Caspase-3 蛋白表达水平明显升高（P<0.01）。FMF（10、50、100 μmol/L）Caspase-3表达水平随药物浓度的增加逐渐减少，且与模型组相比，差异均有统计学意义（P 均<0.01）。见图2 、表3。

图2 FMF 对SH-SY5Y 细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达的影响Fig 2 Effect of FMF on the protein expression of Bcl-2/Bax/Caspase-3 in SH-SY5Y cells

表3 FMF 对SH-SY5Y 细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达的影响（n=6，±s）Tab 3 Effect of FMF on the protein expression of Bcl-2/Bax/Caspase-3 in SH-SY5Y cells（n=6，±s）

表3 FMF 对SH-SY5Y 细胞Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表达的影响（n=6，±s）Tab 3 Effect of FMF on the protein expression of Bcl-2/Bax/Caspase-3 in SH-SY5Y cells（n=6，±s）

Caspase-3 0.476±0.039 1.269±0.068*0.976±0.023Δ 0.719±0.050Δ 0.598±0.044Δ组别正常对照组模型组FMF 低剂量组FMF 中剂量组FMF 高剂量组Bcl-2 0.716±0.049 0.292±0.032*0.342±0.021 0.611±0.020*0.529±0.014*Bax 0.400±0.027 0.828±0.053*0.616±0.039*0.464±0.024*0.486±0.029*Bcl-2/Bax 1.81±0.04 0.37±0.04*0.56±0.03*1.33±0.02*1.10±0.02*

3 讨论

PD 的病因主要与老龄化、遗传和环境等综合因素有关，其发病机制仍未十分清楚。近年来研究认为氧化应激损伤、线粒体功能障碍、细胞凋亡、神经炎症等是造成PD 多巴胺能神经元变性坏死的发病机制，尤其是线粒体功能障碍被认为与PD 发病密切相关［10］。线粒体被誉为细胞的“能量代谢工厂”，通过氧化磷酸化途径产生能量以供给细胞代谢。近年来研究表明，线粒体对于细胞凋亡过程的调节起到关键作用，其结构和功能的改变与细胞凋亡密切相关［11，12］。线粒体功能障碍不仅会损害细胞的能量代谢，而且可导致线粒体氧化呼吸链断裂，活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）大量生成，进一步导致线粒体膜发生脂质过氧化，通透性增高，线粒体膜电位（∆Ψ）降低，线粒体膜通透性转 换 孔（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）开放，最终触发细胞凋亡［11］。

细胞凋亡（apoptosis）是一种由基因控制的细胞自主的程序性细胞死亡。线粒体凋亡途径是细胞凋亡主要途径之一，是由线粒体释放细胞色素C（cytochrome C）继而激活Caspases 级联反应的内源性 凋 亡 信 号 通 路［13，14］。Bcl-2 家 族 蛋 白 在 线 粒 体 凋亡途径中发挥着重要的调控作用。Bcl-2 基因是抑制凋亡因子，定位于线粒体外膜上，具有抑制细胞凋亡的作用［15］。Bax（Bcl-as-sociated X protein）是与Bcl-2 同源的凋亡相关基因，定位于细胞浆，与Bcl-2抑制细胞凋亡的作用正好相反，Bax 是促凋亡因子，促进细胞凋亡［16］。Bcl-2/Bax 比值的变化与线粒体凋亡密切相关。凋亡抑制蛋白Bcl-2 可以通过拮抗促凋亡蛋白Bax 的活性，抑制线粒体释放Cyto‐chrome C，阻止Cytochrome C 激活Caspase 级联反应，从而抑制细胞凋亡［17］。含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）在凋亡执行过程中起到关键的作用。其中Caspase 3 被认为是细胞凋亡过程中最关键的凋亡执行蛋白，它的激活被认为是凋亡进入不可逆阶段的标志［18］。一般情况下，Caspase-3 在细胞中处于无活性状态，当多种刺激因素启动凋亡程序，激活Caspase-3，最终导致细胞凋亡［19，20］。

本实验结果显示，经MPP+诱导损伤后，SHSY5Y 细胞可出现明显的凋亡细胞特征性改变，细胞凋亡率增加，线粒体膜电位升高，Bcl-2/Bax 比值下降，Caspase-3 表达增加，提示细胞发生凋亡，这与文献报道基本一致［21］。FMF 处理后，MPP+对SHSY5Y 细胞的形态损伤有一定的改善，凋亡细胞数下降，线粒体膜电位下降，Bcl-2 表达上调，Bax 和Caspase-3 表达下调，Bcl-2/Bax 比值上升。以上研究结果表明FMF 对MPP+诱导的SH-SY5Y 细胞损伤具有明显的修复作用，其保护机制与有效地调控SH-SY5Y 细胞凋亡相关的蛋白表达，抑制细胞凋亡有关。本研究仅表明FMF 的作用机制与细胞凋亡相关，但有关FMF 通过具体的信号通路调控细胞凋亡，有待后续实验进一步深入的研究，为FMF治疗帕金森病提供实验依据。