植物乳杆菌对发酵香肠蛋白质分解及游离氨基酸的影响

郭文瑞，韩云飞，杨 扬，张艳妮，杨 乐，段 艳*

（1 内蒙古农业大学食品科学与工程学院 呼和浩特010018 2 内蒙古农业大学兽医学院 呼和浩特010018）

发酵香肠是指将肉绞碎、脂肪切块同辅料一起混合后灌入肠衣内，经微生物发酵、干燥成熟而制成的有较长贮藏期，并具有典型风味的发酵肉制品[1-2]。蛋白质、碳水化合物、脂肪是肉制品的三大营养素，可被在发酵过程中产生的酶类及内源酶分解，从而产生大量风味活性物质。发酵香肠的典型风味物质分为挥发性（如醇、酮、醛、呋喃）和非挥发性（如氨基酸、肽、糖、核苷酸）2 类。蛋白质在相关酶（如组织蛋白酶、钙蛋白酶）的作用下分解为多肽，多肽再通过相应的肽酶及氨肽酶分解生成小肽及氨基酸[3-4]，部分生成化合物还可通过Strecker 降解和美拉德反应生成醛、酮等物质[5]，直接或者间接影响发酵肉制品的风味，因此蛋白质分解程度对发酵香肠的品质至关重要。通过筛选蛋白分解能力较强的发酵剂应用于发酵香肠，进而促进其风味物质的产生。有研究发现，市场上使用较多的发酵剂之一——乳酸菌具有很强的蛋白分解能力，特别是乳杆菌[6-7]。本研究拟从内蒙古传统发酵肉制品中筛选出蛋白分解能力较强的植物乳杆菌（X19-2D）应用于羊肉发酵香肠，以汉森发酵剂和自然发酵为对照，探究X19-2D 在羊肉发酵香肠中的蛋白质分解能力及对游离氨基酸产生的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原辅料：苏尼特羊后腿肉及羊尾肥膘、猪肠衣、蔗糖、食盐、黑胡椒粉、孜然粉等，内蒙古呼和浩特市售；抗坏血酸，国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖、亚硝酸钠、硝酸盐，天津市风船化学试剂科技有限公司。

发酵剂：植物乳杆菌（Lactobacilles plantarum）X19-2D，内蒙古农业大学肉品实验室保藏；汉森发酵剂：木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）和戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）。

试剂：磺基水杨酸，南京化学试剂股份有限公司；正己烷（色谱纯），天津市光复精细化工研究所；氧化镁、异丙醇，天津市风船化学试剂科技有限公司；所有分离用有机溶剂均为分析纯级。

1.2 仪器与设备

Kjeltec 8400 全自动凯氏定氮仪，上海瑞玢国际贸易有限公司；HDM-3000C 半微量定氮仪，金坛市荣华仪器制造有限公司；L-8900 全自动氨基酸分析仪，日本日立公司；FSH-2 可调高速匀浆机，常州国华电器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵剂的活化与制备 将植物乳杆菌接种于MRS 液体培养基在37 ℃培育24 h，活化3 次后，于4 ℃下6 000 r/min 离心10 min，弃去上清液，用无菌生理盐水洗涤3 次后重悬，菌悬液保留备用。

1.3.2 发酵香肠的制备

1）基本配方 精选内蒙古市售苏尼特羊后腿肉80%，去筋；羊尾肥膘20%。辅料主要为蔗糖0.5%、葡萄糖0.5%、食盐2.5%、黑胡椒粉0.5%、亚硝酸钠70 mg/kg、硝酸钠100 mg/kg、孜然粉0.5%。

2）制备流程

分组：汉森组（添加汉森商业发酵剂，25 g/200 kg）；X19-2D 组 （添加植物乳酸菌X19-2D，107CFU/g）；自然组（未添加发酵剂）。

3）样品采集 分别于羊肉发酵香肠加工过程中3 d（发酵结束），11 d（加工结束），贮藏（4 ℃真空包装）30，60，90 d，共5 个时间点随机抽取样品，用于后续指标的测定。

1.3.3 氨基态氮的测定 参照孙梦等[8]的测定方法。取4 g 样品，加入40 mL 蒸馏水，振荡30 min，过滤。取滤液20 mL，加入60 mL 蒸馏水，再用氢氧化钠溶液滴定至pH 8.2，向其加入10 mL 甲醛溶液，调pH 值至9.2，记录滴定体积V1。取80 mL蒸馏水做空白试验，记录滴定氢氧化钠体积V0。

式中，V1——样品消耗氢氧化钠体积（mL）；V0——空白组消耗氢氧化钠体积（mL）；C——氢氧化钠标准溶液的浓度 （mol/L）；V——吸取样品稀释液的体积（mL）。

1.3.4 游离氨基酸的测定 参照陶正清等[9]的测定方法。取4 g 香肠切碎并研磨，加入20 mL 质量浓度为5 g/100 mL 的磺基水杨酸溶液，用高速分散器均质（6 000 r/min，30 s，3 次），10 000 r/min（4℃） 离心15 min；取2 mL 上清液加入2 mL 正己烷，振荡，静止待分层后取非有机相，用三蒸水以1∶4 的体积比稀释，然后用0.22 μm 水相滤膜过滤，用L-8900 全氨基酸自动分析仪检测。

仪器条件：分析柱：4.6 mm×60 mm；树脂：2622#；柱温：57 ℃；反应柱温：135 ℃；缓冲液：柠檬酸、柠檬酸钠缓冲液；显色液：茚三酮溶液。

1.3.5 总蛋白的测定 根据《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5-2016） 中的第一法凯氏定氮法进行测定[10]。

1.3.6 TVB-N 的测定 根据《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》（GB 5009.228-2016）中的第一法半微量定氮仪法进行测定[11]。

1.4 数据处理与分析

每个样品均做3 次平行测定，采用SPSS Statistics 18.0 软件做显著性分析，差异显著水平为0.05，极显著水平为0.01；采用Excel 2010 做其它数据统计分析及作图。

2 结果与分析

2.1 氨基态氮含量变化

蛋白质、多肽等含氮化合物在加工及贮藏过程中会逐渐降解，生成小肽、游离氨基酸等物质，氨基态氮的测定通过检测产品中羧基的含量反应蛋白分解情况[12]。如图1所示，在3～11 d，3 组香肠氨基态氮含量均显著升高（P＜0.05），成熟期间微生物产生的蛋白水解酶对蛋白有分解作用[13]，促进氨基酸及小肽的产生，与Wu 等[14]的研究结果一致。发酵11 d，X19-2D 的氨基态氮含量为0.62 g/100 mL 显著高于其它2 组（P＜0.05）。发酵香肠成品贮藏条件为4 ℃，蛋白酶与微生物酶的活性不高，因而导致在贮藏期间各组氨基态氮含量变化不显著（P＞0.05）[15]。贮藏90 d 时，X19-2D 组和汉森组的氨基态氮含量显著高于自然发酵组 （P＜0.05）。此外，据Almeida 等[2]报道乳酸菌产生的外源酶有助于蛋白分解。结果表明，X19-2D 对氨基态氮的产生有促进作用，从而证明其蛋白分解能力较强。

2.2 游离氨基酸含量变化

2.2.1 总游离氨基酸含量变化 游离氨基酸是风味活性化合物，由蛋白质、多肽等在内源酶及乳酸菌产生的外源酶的作用下分解产生，可作为衡量蛋白质降解程度的指标[16-17]。如图2所示，0～3 d 各组香肠总游离氨基酸含量均降低，在发酵过程中，温度在24～25 ℃之间，游离氨基酸遇热降解可与还原糖发生美拉德反应。在发酵3 d 后，总游离氨基酸的含量呈上升趋势，在发酵3～11 d，总游离氨基酸含量增加速率最快，11 d 后上升缓慢，氨基态氮和游离氨基酸测定结果相关性很高，均可作为判断蛋白分解程度的指标。在成熟期（3～11 d）水分逐渐降低，温度较低（14～15 ℃）可降低美拉德反应，蛋白分解的速率远远大于美拉德反应速率，促进FAA 的积累[18]。在贮藏过程中总游离氨基酸含量均为X19-2D 组最高。贮藏90 d，X19-2D 组与汉森组的总游离氨基酸含量差异达到最大值，高达300 mg/100 g。可见，具有蛋白分解作用的乳酸菌X19-2D 促进了游离氨基酸的产生。

图1 各组发酵香肠氨基态氮的变化Fig.1 Changes of amino nitrogen content in each group of fermented sausages

图2 各组发酵香肠总游离氨基酸含量变化Fig.2 Changes of total free amino acids content in each group of fermented sausages

2.2.2 呈味游离氨基酸含量变化 3 组香肠均检测出17 种游离氨基酸，其中Glu 与Ala 含量最高，与Ju 等[19]发酵香肠的研究结果一致。发酵0～3 d，多数氨基酸含量下降；发酵3～11 d，各氨基酸含量增长较快，与吴燕燕等[20]的研究结论一致。在贮藏期间，除Cys、Lys、His 和Arg 以外，其它氨基酸均呈增长趋势，说明多肽在氨基酸酶的作用下不断降解。0～3 d，3 组发酵香肠的Thr 均显示未检测出，第11 天X19-2D 组Thr 的含量为40.513 mg/100 g，而其它2 组仍未检测出。贮藏1 个月，X19-2D 组的Cys 含量为9.896 mg/100 g，汉森组和自然组的Cys 含量过低，且贮藏60 d 汉森组的Cys含量依旧未检测出。结果表明，X19-2D 可促进氨基酸的产生，加速羊肉发酵香肠的蛋白质分解。

检测出的游离氨基酸中Asp 与Glu 具有鲜味，Ser、Gly、Thr、Ala 与Pro 具有甜味，Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg 具有苦味[21]。在加工及贮藏过程中，X19-2D 组的氨基酸Ser、Gly、Thr、Ala、Asp、Val、Met、Ile、Leu、Phe 均高于其它2 组，其中Asp 具有鲜味，Ser、Thr、Gly、Ala 具有甜味。呈现苦味的His 在加工结束及贮藏过程中均低于其它2 组。由图3～图5可知，3～11 d，呈现鲜味、甜味、苦味氨基酸含量提高速度最快，在11 d 之后，各呈味氨基酸含量上升缓慢，说明成熟期间产生的呈味氨基酸积累量决定了发酵香肠的滋味[12]，且3 组呈味氨基酸含量极显著相关 （P＜0.01），说明其变化趋势一致。X19-2D 组呈现甜味、鲜味的氨基酸总量高于其它2 组，呈现苦味的氨基酸略高于其它2 组。经研究发现，呈现苦味的氨基酸过高会影响香肠的品质，然而同时，许多苦味氨基酸也具有增加呈味复杂性，提高鲜度的作用[22-23]。部分引起苦味的氨基酸可作为极具影响香肠风味的前体，如Leu、Val 等，在相应转氨酶及脱羧酶存在的条件下，生成2-甲基丁醛和3-甲基丁醛及3-甲基丁醇，且3-甲基丁醛与硫化合物反应可产生类似培根香味的物质[24]。结果证明，X19-2D 可促进呈味氨基酸的释放，可改善发酵香肠的风味。

2.2.3 必需氨基酸组成评价的变化 食品中蛋白质量不仅要求必需氨基酸的种类齐全，并且氨基酸模式与人体蛋白质氨基酸模式越接近，则营养价值越高。各组香肠必需氨基酸的质量分数与世界卫生组织/联合国粮食及农业组织（WHO/FAO）模式谱对比结果如表1所示，其中各组香肠质量分数最高的是Leu，达到10%以上，在推荐值的1.7 倍以上。其次较高的是Tyr 和Phe 的质量分数，发酵11 d 时，是推荐值的2 倍，逐渐降低接近推荐值，贮藏90 d，X19-2D 组的Tyr 和Phe 质量分数为推荐值的1.3 倍，与其它2 组相比最接近推荐值。汉森组Ile 的质量分数均低于推荐值，X19-2D 组的Ile 质量分数是推荐值的1～1.1 倍。X19-2D 组的Leu 质量分数在发酵11 d 和贮藏30 d 后均低于推荐值，之后是推荐值的1.1～1.4 倍。X19-2D 组的Met 和Cys 与Thr 的质量分数较高，在推荐值之上。随着贮藏时间延长，Tyr 和Phe 的质量分数越接近推荐值。X19-2D 组的Val 质量分数在11 d 时达到最大值8.3%，之后逐渐降低到推荐值的1.3 倍，而其它2 组在贮藏30 d 之后呈上升趋势。综合分析，X19-2D 组发酵香肠的氨基酸模式更接近WHO/FAO 模式推荐值。

图3 各组发酵香肠呈甜味氨基酸含量的变化Fig.3 Changes of sweet amino acids content in each group of fermented sausages

图4 各组发酵香肠呈鲜味氨基酸含量的变化Fig.4 Changes of fresh amino acids content in each group of fermented sausages

图5 各组发酵香肠呈苦味氨基酸含量的变化Fig.5 Changes of bitter amino acids content in each group of fermented sausages

表1 各组发酵香肠人体必需氨基酸占总氨基酸的质量分数变化与WHO/FAO 模式谱比较Table 1 Comparison of the total amino acid content of essential amino acids in each group of fermented sausages and the WHO/FAO model spectrum

（续表1）

2.3 蛋白质的变化

3 组发酵香肠的蛋白质含量的变化如图6所示，在3～11 d，各组香肠蛋白质含量显著上升（P＜0.05），主要原因是在温度为14～15 ℃，湿度为90%～65%的条件下干燥，水分活度降低到0.88 以下，致使干物质的含量显著上升，与刘夏炜[25]的研究结果一致。在贮藏过程中，各组发酵香肠蛋白质含量变化不显著（P＞0.05），均保持在32～36 g/100 g 之间，在贮藏的过程中，由于水分及温度较低，致使蛋白水解酶的活性受到抑制，因而蛋白质分解程度不明显。可知植物乳杆菌X19-2D 对发酵香肠的蛋白含量无显著影响。

图6 各组发酵香肠的蛋白含量的变化Fig.6 Changes of protein content in each group of fermented sausages

2.4 TVB-N 含量的变化

TVB-N 含量反映含氮化合物的降解情况，在内源酶及微生物的作用下，含氮化合物会降解产生具有挥发性的碱性物质，产生腐败的胺臭味，是表示肉制品新鲜度的指标[26]。由图7所示，3 组香肠的TVB-N 含量虽有波动，然而整体呈上升趋势，说明在微生物和酶的作用下，不断的产生大量腐败臭味的代谢产物，使TVB-N 含量持续增高[27]。在3～11 d，X19-2D 组的TVB-N 含量显著下降（P＜0.05），其它2 组显著上升（P＜0.05）；在贮藏60～90 d，X19-2D 组的TVB-N 含量显著下降，其它2 组变化不显著（P＞0.05）。根据许女等[28]报道，接种了植物乳杆菌CP3 处理组香肠的TVB-N 含量显著低于对照组。说明植物乳杆菌X19-2D 在一定程度上可以控制TVB-N 的产生，提高发酵香肠的安全性。

图7 各组发酵香肠TVB-N 含量的变化Fig.7 Changes of TVB-N content in each group of fermented sausages

3 结论

本研究在内蒙古传统肉制品中筛选蛋白分解能力较强的植物乳杆菌X19-2D 为发酵剂应用于羊肉发酵香肠，同时以商业汉森发酵剂和自然发酵为对照，探究X19-2D 对羊肉发酵香肠蛋白降解及游离氨基酸产生的影响。结果表明，X19-2D对氨基态氮的产生有促进作用，在贮藏期间，X19-2D 组的总游离氨基酸含量、呈味氨基酸含量均高于其它2 组，必需氨基酸模式比其它2 组更接近营养推荐值，氨基态氮含量和总游离氨基酸含量测定结果一致，在3～11 d，含量明显增加，在贮藏期间，增长缓慢，说明成熟干燥期间是发酵香肠蛋白分解的主要阶段。3 组蛋白含量无显著差异 （P＞0.05）。在11 d 和贮藏90 d，X19-2D 组TVB-N 含量显著低于其它2 组（P＜0.05）。研究表明，植物乳杆菌X19-2D 组可促进羊肉发酵香肠的蛋白降解，从而增强发酵香肠的风味，其氨基酸组成更有利于人体健康，且在一定程度上可减少TVB-N 的释放，提高产品的安全性。