本土酿酒酵母与商业酵母混菌发酵特性研究

叶冬青，孙 悦，李 莹，杜 青，刘延琳*

（1 西北农林科技大学葡萄酒学院 陕西杨凌712100 2 广西壮族自治区农业科学院农产品加工研究所 南宁530007 3 宁夏大学葡萄酒学院 银川750021）

近年来，随着高通量测序技术的发展，“微生物风土”与葡萄酒风土（terroir）的密切关系已得到研究者的认可[1-2]。具有优良酿酒特性的本土酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可促进产区或地域特色葡萄酒的风土表达[3-4]。使用纯种商业酿酒酵母（S.cerevisiae）酿造葡萄酒可以缩短迟滞期，使酒精发酵过程得到控制，然而该过程会造成葡萄酒同质化，削弱葡萄酒的整体风味特性。相关研究表明，接种优良本土酵母菌或进行多个酵母菌株的混合发酵可增加葡萄酒的复杂性，有助于提高葡萄酒质量[5-6]。不同酿酒酵母菌株混合发酵所得葡萄酒的香气和感官质量，与单菌株发酵结果明显不同，这些差异不能通过调配单菌株发酵后的葡萄酒来获得[7]。King 等[8]研究表明，不同酿酒酵母菌株混合发酵在促进长相思葡萄酒果香硫醇的释放方面，具有协同作用，将筛选自法国勃艮第的多株酿酒酵母进行混合发酵得到的霞多丽[9]、黑比诺[4]葡萄酒的风味均表现得比商业酵母纯种发酵酒更复杂。可见，在发酵体系中引入优良本土酵母是解决葡萄酒同质化的有效方式。然而，我国本土酵母资源的利用尚处于初始阶段，进口商业酵母因极强的发酵性能而被国内大多数葡萄酒生产企业长期使用。至今尚未见商业酵母对本土酵母资源影响的相关报道。明确本土酵母和商业酵母在混菌发酵中的相互关系是发掘利用我国本土酵母资源的重要研究内容。

一般情况下，难以通过常规的生理生化手段实现酿酒酵母菌株水平的区分，必须借助于DNA分子标记方法来完成。目前广泛使用的酿酒酵母菌株区分技术包括：微卫星DNA 标记法、随机扩增多态性DNA 标记法、线粒体DNA 限制性片段长度多态性分析、Interdelta 指纹图谱法以及COX1 基因指纹图谱法等[10-11]，然而这类分子方法需要先提取酵母DNA，进行PCR 后获得图谱进行菌株区分，操作复杂，效率低，更适合应用于分析种群未知的发酵体系。抗药基因是发展最早，应用最广的一类筛选标记，具有应用方便，选择效率高，功能稳定等优良性能，被广泛应用于植物、动物、微生物等遗传系统[12]。自然筛选的酿酒酵母不具卡那霉素抗药性，本研究拟将卡那霉素抗性基因引入混合发酵体系的一个酿酒酵母中，并通过卡那霉素选择标记菌株，从而快速监控混菌系统中各菌株的数量变化。

酵母菌株间的相互作用方式包括生长互作和代谢产物互作2 个方面，其中，氮源和嗜杀毒素是混菌体系中最常见的限制酵母生长和代谢的因素[13]。酵母对可同化氮（Yeast assimilable nitrogen，YAN）的消耗速率具有菌株特异性，其在混菌发酵中对不同氮源的竞争利用可能影响各自的生长及发酵速率[14]。酵母菌在生长繁殖过程中分泌的嗜杀毒素可以杀死或抑制其它酵母[15]。在葡萄酒酿造过程中接种嗜杀酵母，可以净化发酵体系，加速细胞自溶，提升酒的口感[16]。NX11424 是分离自我国宁夏贺兰山东麓葡萄酒产区的本土优良酿酒酵母，作为中性菌株，其在纯种发酵中具有良好的定殖能力[17]，然而，在混菌发酵中，特别是存在商业优势菌及嗜杀酵母的发酵中，其定殖情况需进一步研究。本试验中选取商业优势菌株UCD522 和嗜杀菌株UCD2610，构建带有抗性标记的重组菌株UCD522K 和UCD2610K，并在2 种YAN 质量浓度（55 mg N/L 和433 mg N/L）下验证抗性标记对其菌株发酵的影响，研究NX11424 分别与二者混合接种发酵，以期获得本土酿酒酵母与商业酵母在混菌发酵中的特性及细胞动态变化规律，为研究混合发酵体系中不同酵母菌株的代谢互作机制以及酿造更高品质的葡萄酒奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株与质粒

酿酒酵母菌株NX11424，西北农林科技大学葡萄酒学院微生物资源室；商业酿酒酵母UCD522（Montrachet）、嗜杀菌株UCD2610，美国加州大学戴维斯分校葡萄栽培与葡萄酒酿造系菌种保藏中心赠予；UCD522K、UCD2610K，本试验构建的携带卡那霉素抗性基因的菌株。

质粒pUG6（携带KanMX 基因），武汉淼灵生物科技有限公司；大肠杆菌DH 5α，宝日医生物技术（北京）有限公司。

本试验使用的引物共4 条（表1）：用KanMX基因扩增的上游引物JK_HO-KO-F 和下游引物JK_HO-KO-R，分别引入HO 基因交换位点（用下划线标出） 用于插入染色体；KanMX 基因检测使用上游引物JK_HOKOchk-F（位于HO 基因上游）和下游引物JK_KanRE-R（位于KanMX 中）。

表1 引物序列及其长度Table 1 Primer sequences in this study

1.2 培养基

1）LB 培养基 5 g/L 酵母粉，10 g/L 胰蛋白胨，5 g/L 氯化钠，5 mol/L NaOH 调pH 值至7.0。培养大肠杆菌（E.coli）转化子时需加入氨苄青霉素至终质量浓度为50 μg/mL。

2）YPD 培养基 20 g/L 葡萄糖，20 g/L 蛋白胨，10 g/L 酵母浸粉。

3）重组菌株筛选培养基 在YPD 固体培养基中添加终质量浓度为100 μg/mL 的G418，用于抗性标记菌株的菌落计数。

4）Triple M 模拟葡萄汁[18]110 g/L D-葡萄糖，110 g/L D-果糖，6 g/L L（+）-酒石酸，3 g/L L（-）-苹果酸，0.5 g/L 柠檬酸，0.25 ml/L Tween 80，2.5 mg/L 麦角固醇（90%），6 mg/L 肌醇，0.2 g/L 无水氯化钙，1 g/L L-脯氨酸，0.1 g/L L-色氨酸，0.8 g/L L-精氨酸，1.7 g/L YNB，2.0 g/L 酸水解酪蛋白，1.0 g/L 磷酸铵，此时培养基的YAN 浓度为433 mg N/L，配制55 mg N/L 浓度的YAN 培养基则调整为0.107 g/L L-精氨酸，0.85 g/L YNB，1.0 g/L 酸水解酪蛋白，0.015 g/L 磷酸铵。氢氧化钾溶液调节pH 值至3.25，用0.22 μm 滤膜过滤除菌。

1.3 仪器与设备

基因扩增仪PTC-200 Peltier Thermal Cycler，美国伯乐公司；电泳仪FisherBiotech Electrophoresis Systems、凝胶成像系统UVP Multi-Doc-ItTM Imaging System，赛默飞世尔科技公司；恒温振荡培养箱Branstead Lab-Line Shaker，Marshall 科技公司。

1.4 试验方法

1.4.1 抗性基因的获得 以从大肠杆菌中提取的pUG6 质粒为模板，使用上游引物JK_HO-KO-F和下游引物JK_HO-KO-R 进行KanMX 基因的PCR 扩增，通过1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段，并对PCR 产物进行切胶、回收，利用胶回收试剂盒（QIAquick gel extraction kit）进行纯化。

1.4.2 重组菌株构建及筛选 酿酒酵母（S.cerevisiae）的转化采用LiAc/SS carrier DNA/PEG 方法，具体步骤参照文献[19]。转化子筛选：挑取阳性克隆单菌落进行菌落PCR 验证，检验KanMX 基因，引物为JK_HOKOchk-F 和JK_KanRE-R。

1.4.3 Triple M 模拟汁发酵 将种子以106CFU/mL 的接种量接入装有Triple M 培养基（75 mL）的三角瓶中，在25 ℃下，120 r/min 摇床培养，用CO2失重法监测发酵进程（每隔24 h 称重1 次），含糖量低于2.0 g/L 视为发酵结束。混合发酵中不同菌株的接种数量比为1∶1，每个处理设置3 个重复。YAN 浓度为433 mg N/L 和55 mg N/L。

发酵过程每天取样100 μL，稀释至合适梯度分别涂布YPD 平板和添加了G418 的YPD 平板（每个梯度3 个重复），于28 ℃培养2～3 d，待菌落长出后，进行菌落计数。发酵结束以后的理化指标参照国标《葡萄酒、果酒通用分析方法》（GB/T 15038-2006）测定。

1.5 数据处理

所得数据通过Office 2013 和SPSS Statistics V19.0（IBM Inc.，Chicago，IL，USA）进行均值和方差分析，采用Duncan 检验方法（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 抗性基因的获得

以质粒pUG6 为模板，进行退火温度梯度PCR 扩增。结果表明，60 ℃退火45 s 为最佳条件（图1a）。切胶回收条带长度约为1 800 bp，片段大小正确（图1b）。因此获得纯化的并带有HO 基因交换位点的KanMX 片段PCR 产物。

图1 KanMX 基因扩增（a）和纯化后（b）电泳图Fig.1 PCR（a） and purification（b） of KanMX

2.2 抗性标记重组菌株的构建及验证

为构建含有KanMX 抗性标记的重组酿酒酵母菌株，采用醋酸锂方法，将PCR 后得到的DNA片段整合到酿酒酵母的基因组中，该DNA 片段含有抗性标记和HO 基因的两端同源序列。在含有100 μg/mL G418 的YPD 平板上进行初步筛选后，挑取抗性平板上长出的单菌落进行纯化，纯化后采用菌落PCR 方法验证抗性基因是否已成功整合到UCD522 和UCD2610 的基因组内部。用相应引物同时进行抗性基因KanMX 的检测，分别以原始菌株和受体菌株的单菌落为模板进行菌落PCR 扩增。根据电泳结果（图2），原始菌株的KanMX 基因PCR 扩增为阴性，结果正确（1、2 泳道），KanMX 基因为1 100 bp（3、4 泳道），与预期大小相符。因此，重组菌株UCD522 HO∶∶KanMX（UCD522K）和UCD2610 HO∶∶KanMX（UCD2610K）构建成功。

图2 卡那霉素标记的重组菌株的PCR 验证电泳图Fig.2 PCR detection of the KanMX marking recombinant strains

2.3 抗性标记对菌株发酵性能的影响

通过比较原始菌株UCD522、UCD2610，重组菌株UCD522K 和UCD2610K 的CO2累计释放量的发酵曲线，检验抗性标记是否影响菌株的发酵特征。如图3所示，在2 种YAN 浓度下，重组菌株与相对应的原始菌株的发酵特征基本一致，抗性标记对酵母菌的发酵进程不造成影响。发酵结束后，模拟酒样中的残糖含量均低于2.0 g/L，各菌株均能顺利完成酒精发酵，并且重组菌株与相对应的原始菌株发酵的残糖含量之间无显著差异。

2.4 本土酿酒酵母和商业酵母的混合发酵

2.4.1 发酵指标评价 不同处理的发酵曲线（以CO2累积释放量表示）如图4所示，混菌发酵和纯种发酵的速率在高YAN 浓度（433 mg N/L）下差别不大，各发酵均在第7 天时结束；在低YAN 浓度（55 mg N/L）时，各处理到达发酵终点的时间一致，均为10 d，然而各菌株的发酵曲线差异明显。从图4b 可知，纯种发酵处理中，UCD522K 的发酵速度最快，其累积CO2释放量也最大，NX11424 的发酵速度居中，UCD2610K 的速度最慢。与此相比，混菌发酵的速度位于二者纯种发酵之间，且更接近发酵速率快的菌株，特别是发酵后期（6 d 之后），即在氮源相对不充足的条件下，与NX11424纯种发酵相比，其与UCD522K 混合接种可以提高发酵速率，其与UCD2610K 混合接种则可以保持更为平缓的发酵，说明在实际生产中可以根据发酵原料的情况及目标酒款的特性进行酵母的选择和组合。

图4 NX11424 与UCD522K 或与UCD2610K 在不同YAN 浓度下的纯种及二者混合接种的发酵曲线Fig.4 Fermentation curves of pure and mixed inoculated with NX11424 and UCD522K or with UCD2610K in different YAN concentrations

发酵结束后所得酒样的基本理化指标如表2所示，可见所有处理均能使模拟汁发酵完全，相应酒样中的残糖含量均低于2.0 g/L。混合发酵酒样中的酒精度、总酸、pH 值及挥发酸含量均没有显著差异，说明混合发酵不影响各菌株的发酵特性。

表2 发酵结束模拟酒的理化指标Table 2 Regular physicochemical indexes of synthetic wines

2.4.2 菌株数量的动态变化 本土酿酒酵母NX11424 与商业酵母UCD522K 及UCD2610K 混合发酵及各自纯种发酵过程中各菌株细胞数量的动态变化如图5所示。从发酵整体进程看，混菌发酵和纯种发酵的趋势一致，都在接种第2 天达到最大增殖量，此时各处理组的总菌数量均到达1×108CFU/mL 之上。在后续发酵过程中，混菌发酵的总菌量大体上位于各自纯种发酵之间。

从图5可知，混菌发酵中各菌的数量变化受菌株及氮源条件的影响。在NX11424 与UCD522K 的混合发酵中，NX11424 在高YAN 浓度的整个发酵过程中占主导地位，尤其在发酵第2 天，数量优势明显，其数量是UCD522K 的10 倍左右（图6），之后二者比例下降至2∶1，而在发酵第7 天（发酵末期）的比例有所提高（3∶1）。在YAN浓度为55 mg N/L 时，二者在混合发酵过程中比例维持在约1∶1 的范围，而到发酵第10 天（发酵末期），二者的比例差别明显（8∶1）。由图5b 可见，在低氮条件下，发酵末期UCD522K 的数量快速下降，与纯种发酵相比，其在混合发酵中下降的幅度更缓慢，而NX11424 数量的略有上升。

图5 NX11424 与UCD522K（a，b）及UCD2610K（c，d）在不同处理发酵过程中的细胞数量动态变化Fig.5 Yeast population dynamics of NX11424 and UCD522H （a，b） or with UCD2610K （c，d）during the different fermentations

在NX11424 与UCD2610K 的混合发酵中，二者的数量比受氮源水平的影响不明显，在2 种YAN 浓度的发酵过程中二者的比例基本上维持在1∶1 附近，到发酵末期，NX11424 数量均占优势（图6b）。

图6 NX11424 与UCD522K（a）及UCD2610K（b）在混合发酵过程中的数量比例关系Fig.6 Ratio of NX11424 to UCD522K （a） and to UCD2610K （b） during the mixed fermentations

3 讨论

葡萄酒的发酵过程涉及不同酵母属、种之间此消彼长的变化，监控酵母菌在发酵过程中的动态变化以及不同酵母间的相互作用，是有效调控葡萄酒风味的必要手段。要达到酿酒酵母种内区分，同时兼顾菌种数量动态变化监测，基于形态学的传统鉴定方法难以实现，并且基于DNA 分子标记的鉴定方法操作繁琐，费时较长。因此，本研究引入了抗性标记，将其成功运用到葡萄酒生境的混菌发酵体系中，实现了对发酵过程中不同酿酒酵母菌株数量的快速灵敏监控，是深入研究葡萄酒多菌混合发酵的有效方法。

氮源对酵母的影响包括生物量和糖利用率2个方面[20]。在其它条件最优时，高YAN 浓度的葡萄汁中酵母菌的生长与其发酵能力呈正相关，表现为增加生物量，提高发酵速率的结果[21]。本研究中，各菌株在氮源充足的情况下发酵速度差别不明显，而在低氮（55 mg N/L）条件下，各处理的发酵速度差异明显，这与相关研究的结果类似[22]。该现象可能与不同菌株对氮饥饿的感知能力和信号传导的差异相关，因而形成了一种可以减少能量流动，增加对外界环境压力适应性的机制[23]。氮源作为酵母生长代谢的关键因子，是影响混合发酵的重要因素。Barrajón-Simancas 等[24]的研究认为野生酿酒酵母比商业酿酒酵母消耗更少的氨基酸，与各自纯种发酵相比，二者混合发酵会改变氨基酸的吸收规律，这与不同菌株在竞争互作中代谢活动的改变有关。本研究中，NX11424 与UCD522K在混合发酵中的比例关系受氮源水平的影响。在433 mg N/L 下，NX11424 具有明显的数量优势，占据主导发酵地位，而在55 mg N/L 下，二者比例基本维持在1∶1。可见在混合发酵中，优化氮源条件可以调控混菌体系的组成比例，有利于精准控制葡萄酒的发酵进程。

嗜杀酵母可分泌毒素（通常是蛋白或者外毒素）杀死或抑制其它酵母菌的生长，而自身对嗜杀毒素免疫[25]。因此，在混菌体系中，嗜杀酵母更有利于竞争有限的营养和空间[26]。本土酵母NX11424作为非嗜杀酵母，在与嗜杀菌株UCD2610K 混合发酵过程中，依然保持了稳定的数量，说明该菌株具有一定的抗嗜杀性，这可能与我国工业生产中接种工业嗜杀酵母有关。同时在不同YAN 浓度下，二者的比例基本维持在接种比例附近，说明在混菌体系中二者可以发挥各自的作用，混合发酵具有较大的应用潜力。

4 结论

本研究成功构建了具有抗性标记的重组菌株UCD522K 和UCD2610K，并进行了YAN 浓度为433 mg N/L 和55 mg N/L 条件下的发酵验证，发现重组菌株与相对应的原始菌株的发酵速度和数量基本保持一致，说明抗性标记不影响酵母菌的发酵特征，该技术可以实现混菌发酵体系中酿酒酵母（S.cerevisiae）菌株水平的快速灵敏区分。与纯种发酵相比，混合发酵在高YAN 下不会改变发酵速率，然而在低YAN 下，混菌发酵的速度位于二者纯种发酵之间。混菌发酵中各菌的数量变化受菌株及氮源条件的影响。与UCD522K 的混合发酵中，NX11424 在高YAN 下具有明显的数量优势，而在低YAN 的发酵过程中则基本保持接种比例。在与嗜杀菌株UCD2610K 的混合发酵中，二者的数量比受氮源水平的影响不明显，在2 种YAN浓度的发酵过程中均维持在1∶1 附近。我国本土酿酒酵母NX11424 在与2 株商业菌株的混合发酵过程中，数量均具有竞争力，是具有潜力的酵母菌资源，可为地域特色葡萄酒典型性风格的塑造贡献积极作用。本研究揭示了本土酿酒酵母菌株和商业酵母菌株在不同发酵阶段的消长规律，为研究酵母菌在混合发酵中的代谢互作奠定基础，后期将进一步研究混菌发酵代谢的风味物质及感官质量，为酿酒师选用本土酵母与商业酵母混合酿造工艺提供一定的理论参考。