庆大霉素发酵液检测方法研究

张莉萍，牛 春，石彦鹏， 张 萍

(宁夏泰瑞制药股份有限公司，银川 750002)

庆大霉素(Gentamicin，GM)主要是由绛红小单孢菌(MicromonosporaPurpurea)和棘孢小单孢菌(M.echinospora)发酵产生的一种氨基糖苷类广谱抗生素，对多数革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌中的金黄色葡萄球菌均有较强的抗菌作用，是临床上广泛使用的抑菌抗生素之一[1]。

庆大霉素因自身没有紫外吸收特性，其效价检测一直以来是国内研究热点。主要检测方法有微生物检测法、旋光法和衍生法，目前这些检测方法通常只用于较纯的庆大霉素制剂浓度分析。在发酵生产过程中，由于发酵液中的成分比较复杂，且对发酵液效价检测一般要求需要多次重复的快速检测，微生物检测法操作步骤繁琐复杂、且耗时长，本实验利用庆大霉素的旋光性以及庆大霉素氨基糖苷上的氨基与特定化合物发生衍生反应原理，分别采用旋光法、紫外分光光度衍生法和高效液相色谱衍生法测定降红小单孢菌发酵生产的庆大霉素发酵液效价，通过比较各检测方法测定的效价含量筛选出最适合庆大霉素发酵液的效价检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 出发菌株 绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea)购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，编号4.5706。

1.1.2 培养基及培养条件 斜面培养基(%)及培养条件：可溶性淀粉1.0%，NaCl20.05%，KNO30.1%，CaCO30.1%，K2HPO40.03%，麸皮2.0%，MgSO40.05%，琼脂2.0%，天冬素0.002%，pH7.40～7.60，37 ℃培养7 d[2]。

种子培养基(%)及培养条件：葡萄糖0.1%，玉米淀粉1.0%，玉米粉1.5%，蛋白胨0.2%，黄豆饼粉1.0%，CaCO30.6%，COCl21 ug/mL，KNO30.05%，植物油0.2%，pH自然，34 ℃培养24 h[3]。

发酵培养基(%)及培养条件：葡萄糖0.5%、玉米淀粉5.0%、玉米粉1.0%、蛋白胨0.6%、黄豆饼粉3.0%、CaCO30.7%、COCl20.001%、(NH4)2SO40.1%、KNO30.15%、淀粉酶0.02%和泡敌0.03%，pH7.50～7.60，33 ℃培养4 d[4]。

1.1.3 试剂 庆大霉素标准品 (中国药品生物制品检定所，纯度为 638 u/mg)；甲醛(分析纯)；乙酰丙酮(分析纯)；邻苯二甲醛(OPA)；甲醇(分析纯)；巯基乙酸(分析纯)异丙醇(分析纯)；庚烷磺酸钠(分析纯)；甲酸(分析纯)。

1.2 方法

1.2.1 发酵工艺优化 起始发酵工艺是待斜面孢子成熟后，刮取成熟孢子2 cm2于装有30 mL种子培养液的300 mL直口三角瓶中，34 ℃培养24 h，将扩培活化的种子液按10%接种量转入装有40 mL发酵培养液的300 mL直口三角瓶中，33 ℃培养4 d。本文分别对种瓶接种量和种龄、发酵瓶接种量和发酵周期进行优化。

1.2.2 发酵液预处理 用6 mol/L的硫酸溶液将发酵液酸化至pH1.8-2.0，静置30 分钟后过滤，滤液待用。

1.2.3 旋光法 标准曲线绘制：精密称取庆大霉素标准品适量，分别加水配制成4、6、8、10和12 mg/mL不同浓度的标准溶液，放置自动旋光仪测定旋光度值，标绘制标准曲线。

效价检测：滤液用20%氢氧化钠调pH至6.0-7.0，加入阳离子交换树脂吸附，再用0.5 mol/L的硫酸溶液解析[5]，解析液放置自动旋光仪测定旋光度值。

1.2.4 紫外分光光度衍生法 标准曲线绘制：精密称取庆大霉素标准品适量，加水配制标准品储存溶液，分别用水稀释至浓度20 u/mL、40 u/mL、60 u/mL、80 u/mL和100 u/mL，精密吸取各浓度标准品2 mL置25 mL比色管中，衍生步骤同发酵液样品。

效价检测：将滤液稀释到标准曲线范围内待用。精密吸取稀释滤液2 mL置25 mL比色管中，加衍生剂乙酰丙酮-甲醛溶液5 mL(乙酰丙酮-甲醛溶液配制参考文献[6])，沸水浴30 min，室温冷却，精密加入纯化水7 mL，充分混匀，于339 nm波长处测定吸收度。以纯化水经同样处理后作空白对照。

1.2.5 高效液相色谱(HPLC)衍生法 标准品配制：精密称取庆大霉素标准品，加水配制成10 mg/mL的标准品储存溶液，4 ℃冰箱保存，临用时稀释进行测定。

效价检测：精密吸取滤液4 mL置25 mL比色管中，加衍生剂OPA1.6 mL(OPA溶液配制参考文献[5])，加异丙醇至10 mL，摇匀，60 ℃水浴15 min，至于冰水中终止反应，12 000 r/min离心5 min，取上清待测。色谱流动相为庚烷磺酸钠水溶液(5 g/L)∶甲醇∶甲酸=21∶5∶74；波长330 nm。以纯化水经同样处理后作空白对照。

2 结果与分析

2.1 种瓶接种量和种龄对发酵水平的影响 本文分别刮取斜面生长成熟的孢子1 cm2、2 cm2和3 cm2到种瓶，每隔4 h测种瓶菌体含量，每隔8 h转发酵，探究种瓶接种量和种龄对庆大霉素效价的影响。

图1 种子液生长曲线Fig 1 The growth curve of Seed

种子生长曲线如图1所示，当孢子接种量为1 cm2时，降红小单孢菌从培养第20 h进入对数生长期，48 h后进入平稳期，当接种量为2 cm2时，从培养第12 h进入对数生长期，40 h后进入平稳期，当接种量为3 cm2时，培养8 h后，降红小单孢菌快速进入对数生长期，32 h后菌体生长开始下降。从发酵水平来看，种瓶接种量2 cm2和种龄24 h组合的庆大霉素发酵液效价最高(表1)。这说明种瓶接种量与种龄相互影响，孢子量过大会导致种瓶培养基中菌丝体生长旺盛，提前进入对数生长期，过小则会延迟进入对数生长期。通常种龄以菌丝处于生命力极为旺盛的对数生长期，且培养液中菌体量还未达到最高峰时为宜。若过于年轻的种子接入发酵瓶，往往会出现前期生长缓慢而使整个发酵周期延长，产物开始形成的时间推迟甚至会因菌体量过少而在发酵瓶内结球，造成异常发酵的情况。而过老的种子则会造成生产能力下降，菌体过早自溶。

表1 种瓶接种量与种龄组合结果的效价分析Tab 1 Potency analysis of the combination of seed bottle inoculation volume and seed age

2.2 发酵瓶接种量、发酵周期和发酵液pH值对庆大霉素含量的影响 在最优的种瓶接种量和种龄条件下，我们分别选取8%、10%、12%和14%接种量，从发酵第3 天开始每天放瓶，分别用旋光法、紫外分光光度法和HPLC法测定发酵液效价。

随着发酵周期延长，庆大霉素发酵液的pH整体呈现增长趋势(图2)，而效价呈现先增后减趋势(表2)。当接种量为8%和10%时，发酵第6 天效价达到最高，分别为2179 u/mL和3159 u/mL，此时发酵液pH接近7.5；当接种量为12%时，发酵第5 天达到最高效价4217 u/mL，发酵液pH接近7.5；接种量为14%时，摇瓶效价整体偏低(表2)。这说明发酵瓶接种量与发酵周期也相互影响，降红小单孢菌生产庆大霉素的最佳pH为7.5左右。发酵瓶接种量的大小决定了生产菌种在发酵瓶中的生产繁殖速度。较大的接种量可以缩短发酵瓶中菌丝繁殖到达高峰的时间，使次级代谢产物的形成提前到来，且在生产菌迅速占据整个培养环境时，减少杂菌生长机会。但若接种量过多会导致菌丝生长过快，使培养液黏度增加，造成溶解氧不足而影响代谢产物的形成。

图2 发酵液pH变化Fig 2 The pH change of fermentation broth

表2 发酵瓶接种量与发酵周期组合结果的效价分析Tab 2 Potency analysis of the combined results of fermentation flask inoculation volume and fermentation cycle

2.3 紫外分光光度法、高效液相色谱法(HPLC)和旋光法的比较 紫外分光光度法的标准曲线如图3所示，当庆大霉素浓度在20～100 u/mL之间，其与吸光值呈现较好的线性关系，得线性方程y=156.8x+4.5085，其中y为浓度，x为吸光值，相关系数r2=0.9998。旋光法的标准曲线如图4所示，当庆大霉素浓度在4～12 mg/mL之间，其余旋光值呈现较好的线性关系，得线性方程y=2.2607x+1.9098，其中y为浓度，x为吸光值，相关系数r2=0.9992。

图3 紫外分光光度法的标准曲线Fig 3 Standard curve of ultraviolet spectrophotometry

图4 旋光法的标准曲线Fig 4 Standard curve of polarimetry

分别以优化前和优化后的发酵工艺为培养条件，摇瓶发酵获得庆大霉素发酵液。优化前和优化后的发酵液效价检测结果如表3所示。发酵工艺优化前，三种检测方法测得的庆大霉素发酵液效价约为2600～2700 u/mL，平均相对偏差均小于2%；发酵工艺优化后，三种检测方法测得的庆大霉素含量约为4500～4700 u/mL，平均相对偏差均小于3%。整体来看，三种检测方法测定的庆大霉素发酵液效价相差不大。因此，三种检测方法都能运用在庆大霉素发酵液效价快速检测中。

表3 三种检测方法测定发酵工艺优化前后发酵液效价的比较Tab 3 Comparison of three methods for determining the potency of fermentation broth before and after fermentation process optimization

3 讨论与结论

主要进行了庆大霉素发酵工艺优化以及旋光法、紫外分光光度法和高效液相色谱法三种不同庆大霉素发酵液检测方法在庆大霉素发酵液效价检测中的比较研究。

在发酵工艺优化中，最佳种瓶接种量和种龄的组合为刮取成熟孢子2 cm2于种子培养液，活化培养24 h转接发酵瓶。最佳发酵瓶接种量和发酵周期的组合为按发酵培养液体积的12%吸取种子液到发酵瓶，摇瓶培养5 d后放瓶。发酵工艺优化后的庆大霉素发酵液效价相较于优化前提高70%左右。

旋光法、紫外分光光度法和高效液相色谱法三种检测方法都能运用在庆大霉素发酵液效价快速检测中。旋光法操作简单但其对标准品需求量大，紫外分光光度法和高效液相色谱法均需要经过衍生反应，高效液相色谱法需要出峰时间但能测得庆大霉素各组分含量，紫外分光光度法耗时短但只能测定庆大霉素总体效价。因此在庆大霉素发酵生产过程中，若对时间要求紧迫，可选择紫外分光光度法，若对庆大霉素各组分含量需要定量分析，则可选择HPLC 法作为首选检测方法。