及己根、茎、叶醇提取物诱导肺毒性的比较研究

杜云艳，孙淑萍，杨 梅，董婷玉，吴成华，朱恩泽

(皖南医学院 1.研究生学院；2.药学院；3.天然日化研究所，安徽 芜湖 241002)

及己(ChloranthusserratusRoem.et Schalt.)为金粟兰科金粟兰属植物，产于安徽、浙江、云南等省，常以根或全草入药。《浙江民间常用草药》记载：及己能杀菌消炎、活络舒筋，主要用于治疗跌伤、扭伤、骨折等。研究表明及己水分离部位能剂量依赖性地抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的炎症反应[1]，其根醇提取物还能缓解弗氏佐剂诱导的大鼠关节炎炎症[2]。但过量使用及己可出现中毒，甚至导致死亡。中毒者表现为两肺淤血、水肿，肺毛细血管扩张等[3]。多项指征均表明及己可引起肺损伤，但这种损伤在及己的根、茎、叶提取物中的差异未见报道，且其毒性机制尚不明确。调查发现及己在民间和临床应用中有水煎和酒浸两种方式，市售成方制剂“三七药酒”中含有及己药材，属酒浸方式。因此，本研究通过观察及己根、茎、叶醇提物诱导的肺毒性大小并探讨相关机制，以筛选毒性较小的用药部位，为临床上安全合理使用及己提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物 及己(ChloranthusserratusRoem.et Schalt.)为金粟兰科金粟兰属植物，采于安徽黄山，由皖南医学院朱建华教授根据《中药大辞典》鉴定为真品。分离出及己的根、茎和叶，粉碎成粗粉并保存。

取及己根粗粉，用12倍量的75%乙醇浸泡0.5 h后分别用不同体积量的乙醇回流提取3次(12倍量的75%乙醇回流提取1.5 h，10倍、8倍量的75%乙醇分别回流提取1 h)，将3次滤液合并，减压浓缩、真空干燥、粉碎，得及己根醇(GC)提取物。同法制备及己茎醇(JC)、叶醇(YC)提取物，于室温保存。醇提取物得率(%)=醇提取物重量/粗粉重量×100%。

1.1.2 动物 将鼠龄6周，体质量为(200±10)g的Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠[购自山东省实验动物中心，SCXK(鲁)2014-0007]饲养在通风良好、温度(23±2)℃、相对湿度50%～60%的可控条件下适应性喂养1周，期间自由摄入饲料与饮用水。

1.1.3 试剂 丙二醛(MDA，20190613)、谷胱甘肽(GSH，20190615)、总超氧化物歧化酶(T-SOD，20190616)试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BeyoECL plus化学发光试剂盒(030519190603，上海碧云天生物技术有限公司)；Mouse Anti-β-Actin(66240-1-lg)、Goat Anti-Mouse IgG(BST12F21C50)、Rabbit Anti-HO-1(ZP1039BP39)、Goat Anti-Rabbit IgG(BST12L05A54)、免疫组化三步法试剂盒(12H25C)购自武汉博士德生物工程有限公司；0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na，20180122)购自天津市百世化工有限公司等。

1.1.4 仪器 CKX3OLYMpUS显微镜(昆山诺普森实验室用品科技有限公司)；全自动生化分析仪(深圳市库贝尔生物科技有限公司)；伯乐电泳仪(Bio-Rad)(上海启步生物科技有限公司)；Amersham Imager600超灵敏多功能成像仪(General Electric Company)等。

1.2 急性毒性实验 GC、JC和YC组大鼠分别以剂量为41.4、32.2、11.6 g/kg的对应组醇提取物灌胃。如果未出现死亡，则各组另选两只大鼠给予上述剂量的GC、JC或YC，在48 h内观察大鼠的大体情况变化和死亡率。

1.3 分组及用药 将32只SD雄性大鼠随机均分为正常(KB)组、GC组、JC组和YC组。根据预实验结果和种属间等效剂量折算表[4]，大鼠日给醇提取物量(g/kg)= 3×0.018×5×不同部位醇提取物得率(GC、JC、YC得率分别为15.35%、11.90%、4.31%)× 50，即GC、JC、YC的日给药量分别为2.07、1.61、0.58 g/kg。各提取物组大鼠分别用0.5% CMC-Na溶液配制的相应醇提取物的混悬液灌胃，KB组大鼠用等量0.5% CMC-Na溶液灌胃，每日1次，连续灌胃14 d。

1.4 大鼠一般状态观察及脏器指数计算 给药期间每日观察大鼠一般状况(饮食、饮水、活动、皮毛色泽变化等)，每隔两天称重大鼠，计算体质量变化率。体质量变化率=(测量体质量-原体质量)/原体质量×100%。末次给药1天后，腹腔注射剂量为0.5 mL/100 g的20%乌拉坦溶液麻醉大鼠，并处死大鼠，分离肺组织，称其质量，计算脏器指数，并保存于-80℃，备用。脏器重量与体质量之比的百分数为脏器指数。

1.5 HE染色法检测肺组织病理学变化 取适量肺组织固定在10%甲醛溶液中，脱水后石蜡包埋、切片，苏木素-伊红(HE)染色后，由不了解本实验的两名病理学专家从以下3项病理学改变观察各组大鼠肺组织的病理变化，并评分[5]：①肺毛细血管及肺内出血；②炎性细胞集聚、浸润；③肺泡壁增厚。每项4个评分：0分=无损伤；1分=损伤达观察视野25%；2分=损伤达观察视野50%；3分=损伤达观察视野75%；4分=整个视野弥漫性肺损伤，根据各项评分之和评定病理损伤程度。

1.6 大鼠肺匀浆相关指标检测 取适量肺组织称重，放入匀浆器中，并将组织质量(g)和生理盐水(mL)按1∶9的比例，在冰水浴中匀浆，将匀浆液在4℃、2 500 r/min条件下离心20 min，取上清液，分别按照CAT、T-SOD、GSH、MDA试剂盒说明书测定4个指标的含量。

1.7 免疫组化法检测大鼠肺组织中ICAM-1的表达 按照规定步骤制作切片，脱蜡，依次在100%、95%、85%、75%和50%的酒精中梯度复水。将切片置于纯水中一定时间，灭活、抗原热修复、封闭，与一抗(ICAM-1)孵育过夜、二抗孵育1 h，用SABC试剂处理30 min后滴加DBA显色剂，进行苏木素复染，在显微镜下观察染色程度并拍照，用Image J软件统计阳性表达百分率。

1.8 Western blotting检测大鼠肺组织HO-1的表达 在冰水浴中用裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)将适量肺组织研磨至匀浆状，并在4℃、12 000 r/min条件下离心20 min。取上清液，加入5×上样缓冲液，煮沸10 min使蛋白变性，通过SDS-PAGE分离蛋白并转移到NC膜上。将NC膜用5%脱脂奶封闭2 h，孵育一抗HO-1(1∶200)过夜，室温孵育二抗β-actin(1∶400)1 h，滴入ECL显影液曝光后用Image J软件读取灰度值，进行统计分析。

2 结果

2.1 急性毒性实验分析 在口服剂量高达41.4、32.2和11.6 g/kg时，及己GC、JC和YC未引起大鼠死亡。由此发现GC、JC和YC的LD50分别高于41.4、32.2和11.6 g/kg。因此，选择GC 2.07 g/kg、JC 1.61 g/kg和YC 0.58 g/kg作为评估及己不同部位醇提取物诱导大鼠肺损伤的剂量。

2.2 对大鼠一般体征的影响 各组大鼠均存活，无死亡现象。其中，KB组大鼠活动、饮食和排泄均正常，皮毛光泽。GC组大鼠活动状态较好，其皮毛光泽度以及饮水、饮食量也较为正常。JC组大鼠皮毛失去光泽，手感粗糙，且其活动，饮水、饮食量较KB和GC组均减少。YC组大鼠活动度差，嗜睡，脱毛，饮食消耗量和以上几组相比减少。

2.3 对大鼠体质量的影响 给药期间KB组大鼠体质量正常增长，GC组体质量增长速度较快，其次是JC和YC组。从第3天到第13天，各组大鼠体质量变化差异无统计学意义(P>0.05)；而在第15天，JC和YC组大鼠的体质量变化相比于KB和GC组均降低(P<0.01)，见表1。

表1 各组大鼠体质量变化情况 g

2.4 对大鼠肺大体形态的影响 肉眼可见KB组肺为淡粉红色，表面较光滑，无其他异常；GC组肺表面有少量出血点；YC组、JC组出血点较明显，表面较粗糙，脏器呈深红色，且YC组出血点更多，如图1。

图1 各组大鼠肺大体形态

2.5 对大鼠肺指数的影响 与KB组相比，GC、JC及YC组肺指数均降低，但差异无统计学意义(F=3.407，P=0.074)，见图2。

图2 各组大鼠肺指数的变化

2.6 对大鼠肺组织形态学的影响 HE染色结果显示KB组大鼠肺泡结构完整且清晰可见。GC组肺泡结构清晰完整，有少量炎细胞浸润、肺泡及间质内轻微出血。JC和YC组可见大量炎细胞浸润、肺水肿及淀粉样变性，壁间质、细支气管壁明显增厚，YC组甚至出现纤维排列紊乱，细胞质间隙出血等。病理学评分中JC、YC组肺组织病理评分较GC组均升高(P<0.05)，且YC组更明显，见图3、表2。

表2 各组大鼠肺组织病理学评分

图3 各组大鼠肺组织形态学的变化(KB×200，GC、JC、YC×100)

2.7 对大鼠肺匀浆指标MDA、GSH、SOD和CAT含量的影响 与空白组相比，GC组各指标含量变化差异均无统计学意义(P>0.05)。与KB和GC组相比，JC和YC组MDA含量均升高(FA=16.157，P<0.01)；GSH含量均降低(FB=5.348，P<0.05)。与KB和GC组相比，JC和YC组SOD和CAT含量均降低(FC=16.262，FD=16.576，P<0.01)。除此之外，YC组SOD和CAT的含量较GC组也降低(P<0.01)，见图4。

与KB组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与GC组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

2.8 对肺组织中ICAM-1表达的影响 与KB组相比，GC组ICAM-1阳性表达率的升高无统计学意义(P>0.05)，而JC和YC组ICAM-1阳性表达率升高(P<0.05)。与GC组相比，JC、YC组大鼠肺组织中ICAM-1阳性表达均升高(P<0.05)，但YC组更明显，见图5。

与KB组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与GC组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

2.9 对肺组织中HO-1蛋白表达的影响 与KB组相比，GC组大鼠肺组织内HO-1蛋白表达升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；JC和YC组HO-1蛋白表达均下降(P<0.05)，且其下降幅度较GC组有统计学意义(P<0.05)，如图6。

与KB组相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；与GC组相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

3 讨论

体质量变化率和器官指数是评估药物毒性的基本指标。通常各脏器指数数值相对恒定，但其可因脏器萎缩而降低，充血或增生而升高[6]。在本实验中，JC和YC组大鼠活动减少，体质量增长缓慢，且肺指数下降较明显，提示JC和YC对大鼠的健康产生了一定的影响。结合病理组织学结果，进一步表明及己JC和YC可明显诱导雄性大鼠的肺病理学损伤。

氧化应激损伤是细胞或组织损伤的重要途径之一，由氧化/抗氧化平衡稳态被打破造成[7]。MDA是脂质氧化损伤指标的最佳“生物标志物”[8]。GSH为一种能抵抗氧化应激损伤的细胞保护剂和抗氧化剂[9]，其体内含量的变化可反映机体清除自由基和抗脂质过氧化损伤的能力[10]。机体内的保护酶CAT及SOD含量也可作为判断组织是否受损的指标。SOD能有效清除体内的O2-，其含量降低，则细胞清除自由基的水平降低，造成氧化应激损伤[11]。本研究中JC和YC能增加大鼠肺匀浆MDA水平，降低SOD、GSH和CAT水平，但GC对4个指标的变化均不明显，这在一定程度上佐证及己JC、YC具有肺毒性的观点，以YC最为突出。

ICAM-1能辅助白细胞到达炎症部位，从而调整免疫防御系统。在有肺部炎症的肺组织中ICAM-1含量会明显增加。因此，ICAM-1水平的高低是指示肺组织是否受损的重要指标之一[12]。在本研究中，与肺匀浆各指标结果相一致，JC、YC组大鼠肺组织中ICAM-1阳性表达水平升高，而GC组变化幅度较小，这表明YC、JC组大鼠肺组织均严重受损，且YC组损伤更严重。

HO-1为保护性蛋白，但长时间的毒物刺激会使得其水平降低[13]。本实验中，GC组HO-1表达水平略微上升，可能是由于GC组具有较好的抗炎效果[1-2]，JC、YC组均明显降低，说明JC、YC均能引起氧化应激损伤，且YC诱导的损伤更明显。

综上所述，及己YC、JC可能通过氧化应激引起较严重的大鼠肺损伤，而GC引起的肺损伤不明显，说明及己根是较好的药用部位。今后我们会对肺损伤的具体机制和根部药用部位作进一步的研究，进而为及己在临床的广泛应用提供基础，大大降低及己用药中毒的可能性。

(致谢：感谢皖南医学院病理学教研室黄小梅副教授和芜湖市第五人民医院副主任医师李胜利老师对实验中病理评分的指导。)