间接免疫荧光法与免疫印迹法联合检测2967份血清自身抗体结果分析

段玲，邓德耀，黄兴凤，高宗鹰，江河，韩明勇，顾津伊，龙湖波，吕红玲

(云南省第二人民医院 检验科，云南 昆明 650000)

0 引言

自身免疫性疾病(autoimmune disease，AID)是由于机体免疫系统受环境或遗传等因素作用，使自身免疫耐受遭到破坏，产生针对自身正常或变性的组织、器官、细胞、蛋白质或酶类等自身抗原的免疫应答，导致对自身组织或器官损伤或功能障碍。当发生自身免疫性疾病时，机体免疫系统产生了针对自身成分的自身抗体。近年来研究表明，抗核抗体与自身免疫性疾病之间有着密切的联系[1]。抗核抗体检测是自身免疫性疾病的重要标志，目前临床实验室中检测自身抗体的方法主要有：间接免疫荧光法(IIF)、抗核抗体谱免疫印迹法(LIA)、酶联免疫法(ELSIA)、双向免疫扩散(RID)和放射免疫技术(RIA)等。本研究探讨联合使用IIF-ANA与LIAANAs检测自身抗体，分析两种检测方法结果间的相关性及对AID诊断的临床意义。

1 资料与方法

1.1 基本资料

收集我院住院期间疑似或确诊为自身免疫性疾病2967份血清标本，静置30min后，离心分离血清(转速：3000r/min，离心时间3分钟)。离心分离后的血清标本同时采用IIF检测ANA及LIA检测ANAs，当日不能及时检测的血清放2℃—8℃冰箱保存。

1.2 方法

IIF检测ANA，采用德国欧蒙实验室诊断有限公司生产的间接免疫荧光试剂盒，每次实验过程中均设阴、阳性对照，实验过程严格按照试剂盒提供的说明书及本实验室的操作规程(SOP文件)进行，采用尼康50i荧光相差显微镜观察结果，根据细胞或组织内特异性荧光将荧光模型判为：着丝点型、胞浆颗粒型、核颗粒型、核仁型、肌动蛋白、波形蛋白、均质型、核点型、核周型、中心粒等。检测滴度分为：＜1：100、1：100、1：320、1：1000、1：3200及＞1：3200。LIA检测ANAs，采用德国欧蒙免疫印迹法试剂盒(抗核抗体谱15项)，可检测抗RNP、抗SM、抗SSA、抗SSB、抗JO1、抗SCL70、抗着丝点B蛋白、抗核小体、抗组蛋白、抗P蛋白、dsDNA抗体、AMA-M2等15种抗体，实验过程严格按照试剂盒提供的说明书及本实验室操作规程(SOP文件)进行。

2 结果

2967份血清样本同时采用IIF与LIA法检测，IIF检测阳性率16.35%(485/2967)，LIA检测阳性率11.53%(342/2967)，两种方法检测总阳性率为17.32%(514/2967)，IIF检测敏感性较好；两种方法检测均阳性共313例，符合率是10.55%(313/2967)；IIF阳性而LIA阴性时为5.8%(172/2967)，LIA阳性而IIF阴性时为0.98%(29/2967)。见表1。

表1 IIF与LIA两种方法同时检测抗核抗体的结果比较

342例LIA阳性标本，表现出不同的特异性抗体，主要表现 为：抗SSA37.67%(217/576)，抗AMA-M212.5%(72/576)，抗SSB抗体10.76%(62/576)，其余均低于10%。其中29例IIF检测抗核抗体滴度＜1：100的标本，其LIA亦检测出不同的特异性抗体，主要为抗SSA抗体14例38.89%(14/36)，抗AMA-M2抗体10例27.78%(10/36)，抗SM、抗SSB、抗P蛋白抗体分别各2例5.56%(2/36)，抗Jo1、抗着丝点B蛋白、抗核小体各1例2.78%(1/36)，表明若单独只用IIF检测抗核抗体，易造成以抗SSA、抗AMA-M2为主要阳性抗体的标本漏检。本组数据还显示LIA检测阳性率与IIF检测荧光强度无明显的正负相关性。在IIF1：320时LIA检出的抗体阳性数最多，这可能与在此滴度收集到的标本数量最大有关。见表2。

表2 不同滴度下IIF-ANA标本中LIA-ANAs的检测结果(n=342)

2967例血清标本中，IIF、LIA同时检出阳性标本共313例，其中当荧光模型表现为核颗粒型时，对应的特异性抗体主要有：抗SSA42.17%(194/460)，抗SSB12.83%(59/460)，抗RNP10.87%(50/460)；胞浆颗粒型：抗SSA 33.22% (96/289)，抗AMA-M217.99%(52/289)，抗P蛋白抗体9.69%(28/289)；着丝点型：着丝点B蛋白抗体62.75%(32/51)，抗AMA-M219.61(10/51)，抗SSA7.84%(4/51)；核仁型：抗SSA40%(16/40)，抗SSB17.5%(7/40)，抗P蛋白抗体15%(6/40)，此表明荧光模型核颗粒型与抗SSA抗体、抗SSB抗体；着丝点型与抗CENP-B抗体；胞浆颗粒型与抗AMA-M2抗体有较高相关性，这与文献[2]研究基本一致。各特异性抗体总检出率抗SSA抗体36.48%(313/858)，抗AMA-M2抗体11.54%(99/858)，抗SSB抗 体11.19%(96/858)，其 余 均 低 于10%。见表3。

表3 IIF-ANA的荧光模型与LIA-ANAs抗体之间相关性(n=313)

3 讨论

自身免疫性疾病的发病率占世界总人口的3%-5%，已成为严重影响人类健康的疾病，自身抗体检测对AID诊断和鉴别诊断、病情评估与治疗监测、病程转归与预后判断等都具有重要的临床应用价值[2]，但在实际工作中发现，有时一些明确诊断为AID的患者，ANA筛查试验结果为阴性，而部分筛查结果为阳性的，最后诊断为非AID患者[3-4]。抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)是一组将自身各种细胞核成分作为靶抗原的自身抗体的总称，主要是IgG，也有IgM、IgA和IgD，无器官和种属特异性，故该类抗体可与所有动物的细胞核发生反应。IIF检测ANA时最常用核质丰富的培养细胞HEP-2细胞作为抗原，针对整个细胞核、细胞质、细胞骨架、细胞周期等成分抗体进行检测，通过其荧光模型进行判读，其灵敏度相对更高[5-7]，且具有检测操作方便、检测范围广的特点。但IIF对检测AID特异性相对较低，检测自动化程度低，操作标准化较难[8]。LIA法可选择不同的组合一次检测多种特异性抗体，该法有操作简便快捷、结果判读方便、易自动化等优点，但目前LIA只能检测有限的15种抗体，特异性强，但灵敏度低。

本研究通过对2967份应临床需要送检血清标本中自身抗体检测结果进行回顾性分析，分析研究表明IIF检测的敏感性较好，但仍存在部分假阴性，假阴性占0.98%。文献表明与HEP-2细胞为抗原基质检测自身抗体时，由于抗原分布不均、含量低以及不同方法对特定抗原的破坏等因素的影响有关，导致IIF存在一定的假阴性[9]。另外IIF检测方法采用的二抗是抗IgG的抗体，而抗核抗体主要是IgG，也有IgM、IgA和IgD，对后三种抗体的忽略也可能是造成IIF漏检的原因之一[10]。IIF阳性而LIA阴性占5.8%，IIF阴性而LIA阳性占0.98%，LIA假阴性率高于IIF法，LIA检测抗核抗体具有较高的特异性，但目前免疫学所能检测的抗核抗体种类有限，仅为自身抗体中一小部分，仍有大量的未知特异性抗体未被认识或未应用于临床检测。临床实验中提高LIA的检出率，更多的可提取性核抗原的提取对自身免疫性疾病的临床意义不可忽略。

单纯用IIF检测，易造成LIA检测抗SSA抗体、抗AMA-M2抗体阳性的标本漏检；而抗SSA抗体对SLE和亚急性皮肤型SLE的诊断具有重要意义。国内外也有许多报道证实ANA阴性亚型SLE患者的存在，原因可能是此类患者体内因抗体被受累组织结合或应用糖皮质激素或免疫抑制剂等导致ANA阴性[11]。实际应用中，IIF检测针对整个细胞核，线粒体型抗体分为很多型，而LIA检测仅针对AMA-M2型抗体，所以易造成AMA-M2在IIF中的漏检。有研究表明，临床疑似RA、PM、DMM等疾病的患者，即使IIF筛查阴性，亦应用LIA法检测抗SSA特异性抗体，以提高基本的检出率[12]。

本研究还表明LIA检出率与抗体滴度无明正负相关性，并不是滴度越高检出率越高。本组数据显示在1：320滴度时检出率较高，可能与在此滴度范围收集的标本量较大有关。本组研究中LIA检测阳性的342例标本提示，检出的主要特异性抗体为：抗SSA37.67%(217/576)，抗AMA-M212.5%(72/576)，抗SSB抗体10.76%(62/576)，其余均低于10%。抗SSA抗体最常见于干燥综合症、SLE及原发性胆汁性肝硬化、类风湿关节炎、多发性肌炎，偶见于慢性活动性肝炎，抗SSB抗体可出现在干燥综合症、SLE患者血清中，在干燥综合症中抗SSA、抗SSB常同时出现[13,14]；高滴度的AMA-M2抗体是原发性胆汁性肝硬化的标志，但在慢性肝脏疾病、进行性系统性硬化症中也可阳性。这部分抗体LIA检测的阳性率较高，但是对AID诊断的特异性不强[15]。

IIF、LIA检测同时阳性的313例标本中，荧光模型表现为核颗粒型时，主要见抗SSA抗体42.17%，抗SSB抗体12.83%，抗RNP抗体10.87%；胞浆颗粒型：抗SSA抗体33.22%、抗AMA-M2抗体17.99%，抗着丝点P蛋白9.69%；着丝点型：着丝点B蛋白抗体62.75%，抗AMA-M2抗体19.61%，抗SSA抗体7.84%；核仁型：抗SSA抗体阳性40%，抗SSB抗体17.50%，抗着丝点P蛋白15%。核颗粒型、胞浆颗粒型、核仁型LIA检测阳性的特异性抗体主要为：抗SSA，抗AMA-M2，抗SSB抗体，着丝点型主要表现为着丝点B蛋白抗体阳性，表明IIF荧光模型与LIA特异性抗体之间有一定的关系，但没有绝对的规律可寻，不能通过分析荧光模型判断相应的特异性抗体。

综上所述，IIF检测表现出较高的阳性检出率但对AID特异性低，而 LIA检测ANAS时存在较高的假阴性，两者存在一定的相关性又各有差异。一种自身免疫性疾病有多重自身抗体，IIF和LIA两者联合检测可提高检出率，降低漏检率，两种方法不可相互取代，临床中联合检测对自身免疫性疾病的诊断、病情监测及预后判断具有重要的临床意义。