药品限度检查中霉菌总数测定培养基的优化

(1临沂市兰山区人民医院，山东 临沂 276000；2临沂大学药学院)

药品微生物限度检验是保证药品使用安全的重要工作，也是控制药品质量的重要指标之一，药品染菌程度直接影响其内在质量。霉菌在自然界分布广泛，药品最易受其污染，轻者有效成分会被分解，重者还可能会产生某些毒素，造成患者的机体反应，引发疾病甚至危及生命。目前，平板菌落计数法是国内外药品霉菌总数检测常用方法之一，培养基的质量直接影响检测的结果。为此，本研究在国际常用玫瑰红钠琼脂培养基的基础上添加不同浓度的葡萄糖、酵母膏和吐温，对不同的样品进行霉菌总数检测，优选出适宜的改良培养基，使霉菌菌落更清晰易检、提高检出率。

1 材料和方法

1.1试验材料 试验菌种：黑曲霉、青霉由临沂大学药学院微生物教研室提供。试验药品：维生素C片、急支糖浆、养胃丸、益母草颗粒、肤轻松软膏、珍视明滴眼液从药店购买。改良马丁琼脂斜面培养基的制备：称取蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、酵母粉2 g、琼脂14 g，量取蒸馏水或去离子水1000 mL，最终pH调至(6.4±0.2)，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，116℃高压灭菌30 min，备用。玫瑰红钠琼脂培养基(A0)的制备：称取蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、磷酸二氢钾1 g、硫酸镁0.5 g、玫瑰红钠0.0133 g、琼脂14 g，量取蒸馏水或去离子水1000 mL，最终pH调至(6.0±0.2)，搅拌加热煮沸至完全溶解，分装三角瓶，121℃高压灭菌20 min，备用。改良培养基的制备：在A0的基础上，分别添加不同浓度的灭菌葡萄糖(A1)、酵母膏(A2)和吐温(A3)制成。

1.2试验方法

1.2.1样品制备 (1)霉菌菌液的制备[1-2]：将含黑曲霉、青霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，设定条件下培养5～7 d，加入3～5 ml 含0.05 % (mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌NaCl溶液洗脱孢子，然后吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05% (mL/mL)聚山梨酯80的0.9%无菌NaCl溶液制成含孢子数50～100 CFU/mL的孢子悬液。菌液制备后若在室温下放置，应在2 h内使用；若保存在2℃～8℃，可在24 h内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2℃～8℃，在验证过的贮存期内使用。(2)药品样品液的制备。①维生素C片、益母草颗粒：样品10 g+稀释剂90 ml(pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液)为1∶10供试液，最低稀释级作为验证供试溶液；②急支糖浆、珍视明滴眼液：样品10 ml+稀释剂90 ml为1∶10供试液；③养胃丸、肤轻松软膏：样品10 g+20 ml无菌十四烷酸异丙酯充分振荡溶解+45℃稀释剂90 ml为1∶10供试液。

1.2.2霉菌总数的检测 每个培养皿中加入样品适宜稀释液1 ml，并分别和不同试验培养基混匀静置后，在25℃～28℃的温度下置于培养箱中培养，培养3 d后观察计数，每个试验重复3次。

1.2.3培养基的优选 (1)添加葡萄糖的试验：在A0基础上分别加入0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的灭菌葡萄糖，制备改良培养基，对纯种黑曲霉和青霉的混合菌液进行霉菌总数的检测。(2)添加酵母膏的试验：加入的灭菌酵母膏的浓度分别为0.2%、0.4%、0.6%和0.8%，方法同(1)。(3)添加吐温的试验：添加的灭菌分散剂吐温80的浓度分别0.1%、0.15%、0.2%和0.25%，方法同(1)。

2 结果与分析

2.1A1培养基检测霉菌 添加1.0%葡萄糖的A1培养基对霉菌的检出率提升最明显，葡萄糖含量太高或太低都会降低检出率。见表1。

2.2A2培养基检测霉菌 添加不同浓度酵母膏的A2培养基，其霉菌检出率均降低。见表2。

2.3A3培养基检测霉菌 加入不同浓度吐温80的A3培养基对霉菌总数的检出率均高于A0培养基，添加0.15%吐温80培养基的检出率最高。见表3。

2.4优选的培养基对不同药品中霉菌的检测 采用添加1.0%葡萄糖与0.15%吐温80的A0培养基(A4)对6种药品进行霉菌总数检测，每个稀释度作3个平皿，培养3 d后观察。结果表明，A4培养基对不同药品中的霉菌的检出率均有提高，平均高出25.08%。见表4。

表1 A1培养基对霉菌的检出结果

表2 A2培养基检测霉菌的结果

表3 A3培养基对霉菌总数的检测结果

表4 A4与A0培养基检测霉菌总数情况

3 讨论

葡萄糖是最易被霉菌吸收利用的初始碳源，有利于霉菌的生长代谢。但含葡萄糖的培养基经高温灭菌后容易产生有害色素，导致培养基成分变化，所以要分别灭菌后再混合[3]。葡萄糖可以过滤除菌，也可以在115℃、15 min灭菌。本研究试验证实，添加1.0%葡萄糖的培养基其霉菌检出率最高，而添加1.5%、2.0%葡萄糖的培养基其检出率反而降低，说明只是在适当增加C/N比时才有利于霉菌的生长。

自然界霉菌孢子常多个聚集在一起，要想得到更准确结果，就必须使其充分分散。吐温80是一种非离子型的表面活性剂，可有效加强液体的流动性从而使培养基中的物质分布均匀，降低两相界面张力，使孢子在培养基中充分分散，减少菌落聚集，从而大大提高霉菌菌落检出率。本研究结果证实，添加0.15%吐温80的培养基上生长出的霉菌菌落小而且分布均匀，易计数，其检出率最高。

总之，提高霉菌检出率，一定要优选出适宜的改良培养基，不但要合理搭配培养基的成分，还要严格按照药品微生物限度检查的操作规范进行，才能使霉菌菌落更清晰易检，从而提高检出率。