HLA-G、Wnt5a和β-catenin蛋白在重度子痫前期胎盘组织中的表达及临床意义

万莉萍，张雪梅，万虹利，高春元，关小红

(1.成都市龙泉驿区妇幼保健院妇产科，四川 成都 610100；2.四川省交通运输厅公路局医院妇产科，四川 成都 610097；3.同济大学附属第一妇婴保健院妇产科，上海 200129)

子痫前期属于妊娠高血压疾病的一种，指怀孕前血压正常，妊娠20周后出现高血压、蛋白尿等症状的妊娠期特发性疾病[1]。调查研究[2-4]显示，子痫前期的全球发病率为5%～7%，国外发病率为2%～8%。重度子痫前期是子痫前期发病的重要阶段，常引起孕妇心力衰竭、胎盘早剥、肺水肿，胎儿早产、生长受限等，严重者甚至会导致孕妇和新生儿死亡[5-6]。目前，医学界认为子痫前期是由多因素、多通路的复杂机制所致，但具体发病机理尚未完全阐明。研究[7]显示，母胎界面局部免疫系统耐受和滋养细胞侵袭力下降在子痫前期进展过程发挥重要作用的，也是子痫前期发病机制的研究热点。人类白细胞抗原G(HLA-G)属非经典性人类白细胞Ib类抗原分子，在母胎免疫耐受中发挥着重要的作用[8]。研究[9]发现，Wnt信号通路是一个复杂的蛋白质作用网络，在胚胎发育及肿瘤发生过程中起着至关重要的作用。β-catenin介导Wnt经典通路，Wnt5a介导Wnt非经典信号通路，共同调节肿瘤细胞的增殖、发育、黏附、组织代谢和迁移能力。因胎盘滋养细胞生物学行为类似于肿瘤细胞，故推测重度子痫前期的发生可能与β-catenin和Wnt5a蛋白的异常表达有关。本研究通过分析HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白在重度子痫前期胎盘组织中的表达及定位情况，以期为临床诊治提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

研究经本院伦理委员会批准，研究对象均自愿参与并签署知情同意书。选取2017年8月至2020年8月成都市龙泉驿区妇幼保健院妇产科剖宫产分娩的80例重度子痫前期患者作为研究组。患者年龄22～42岁，平均(30.23±5.12)岁；孕周30～40周，平均(35.31±2.84)周。另选取同期80名剖宫产正常妊娠孕妇作为对照组。孕妇年龄23～42岁，平均(30.57±5.26)岁；孕周29～40周，平均(35.13±3.05)周。两组研究对象在年龄、孕周比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。重度子痫前期的诊断参照《妊娠期高血压疾病诊治指南(2015)》[10]中的诊断标准，孕妇均为单胎、剖宫产分娩。排除多胎、冠心病、肿瘤、脑梗死、精神疾病、内分泌系统疾病、自身免疫性疾病、先天性遗传性疾病、生殖器官畸形或其他妊娠相关综合征疾病(原发性高血压、妊娠期糖尿病等)的孕妇。

1.2 方法

1.2.1 标本收集 孕妇剖宫产分娩后，在无菌状态下立即取其胎盘组织(胎盘母体面距脐带附着处2～3 cm范围内剪取胎盘绒毛组织，应避开钙化灶、机化灶、出血灶等区域组织)，然后使用无菌生理盐水反复冲洗，并分割为1 cm×1 cm×1 cm的组织块。一部分组织块分装于液氮保存，用于提取蛋白质；另一部分组织块保存于4%多聚甲醛，用于免疫组织化学实验。

1.2.2 蛋白质印迹法检测Wnt5a和β-catenin蛋白水平 取胎盘组织约150 mg，提取并检测蛋白浓度，上样前将样品于沸水中煮5 min，使蛋白变性后，采用12%十二烷基硫酸钠聚-丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)进行电泳来分离蛋白，然后将蛋白转至硝酸纤维素滤膜。采用5%脱脂奶粉封闭2 h，小鼠抗人HLA-G单克隆抗体(稀释比例1∶100，美国abcam公司)、兔抗人Wnt5a多克隆抗体(稀释比例1∶500，美国Signalway公司)、兔抗人β-catenin多克隆抗体(稀释比例1∶1 000，美国Cell Signaling Technology公司)4 ℃孵育过夜。用TBS-T洗涤膜3次，每次5 min。辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(稀释比例为1∶2 000，北京中杉金桥公司)和山羊抗兔IgG抗体(稀释比例为1∶5 000，北京中杉金桥公司)孵育2 h，再用TBS-T洗涤膜3次，每次5 min，然后用TBS冲洗。采用增强型化学发光液(美国Thermo公司)进行条带显色。用Image-ProPlus5.1图像分析软件对各蛋白条带进行分析，HLA-G以β-actin为内参照，Wnt5a和β-catenin以GAPDH为内参，计算各蛋白相对表达量。

1.2.3 免疫组化法检测 HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的表达和定位情况 取出经4%多聚甲醛固定后胎盘组织，常规行脱水、浸蜡、石蜡包埋及连续切片(厚0.3～0.4 μm)等操作。采用免疫组化检测试剂盒(中国福州迈新公司)检测组织中HLA-G、Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白的表达和定位情况。采用NIS-Elements软件对图像进行采集，各图片参数要求设置应保持一致，以保证所采集的图像具有可比性，并采用Image pro plus软件进行分析各蛋白的平均光密度水平。

1.2.4 临床特征 两组对象均于入院第1天测定入院平均动脉压，留取孕妇入院当天上午8∶00至次日8∶00的24 h尿液，应用罗氏Cobas 501生化分析仪检测24 h尿蛋白水平，并记录孕妇妊娠胎儿出生体重。

1.3 观察指标

比较两组研究对象入院平均动脉压、24 h尿蛋白、胎儿出生体重、蛋白质印迹试验中HLA-G、Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白的相对蛋白表达、免疫组化试验中HLA-G、Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白的定位及平均光密度，分析HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白之间的关系及与患者临床特征的相关性。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 两组临床特征比较

研究组孕妇入院平均动脉压和尿蛋白水平均高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；而两组胎儿出生体重比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组孕妇的临床特征比较

2.2 两组胎盘组织中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的相对表达情况比较

研究组胎盘组织中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的相对表达水平均低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2及图1。

表2 两组胎盘组织中HLA-G、Wnt5a蛋白、β-catenin蛋白的相对表达情况比较

2.3 胎盘组织中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的定位情况

免疫组化结果显示，HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白在两组胎盘组织中均有蛋白表达，其中HLA-G和β-catenin蛋白主要定位于细胞滋养细胞的细胞质，Wnt5a蛋白主要定位于合体滋养细胞的细胞质，见图2。研究组胎盘组织HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的平均光密度水平均低于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 两组胎盘组织中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的平均光密度水平比较

2.4 胎盘组织中HLA-G、Wnt5a与β-catenin的相关性分析

孕妇胎盘组织中HLA-G蛋白表达与Wnt5a和β-catenin蛋白表达均呈正相关(r=0.768,0.711；P<0.05)，Wnt5a和β-catenin蛋白表达呈正相关(r=0.764，P<0.05)。见图3。

2.5 胎盘组织中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白与患者入院平均动脉压和尿蛋白的相关性分析

孕妇入院平均动脉压水平与胎盘组织中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白表达均呈负相关(r=-0.537、-0.516、-0.498，P<0.05)，孕妇尿蛋白水平与胎盘组织中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白表达也均呈负相关(r=-0.492、-0.457、-0.412，P<0.05)。见表4。

表4 胎盘组织中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白与患者入院平均动脉压和尿蛋白之间的相关性分析

3 讨论

免疫学认为妊娠相当于同种异体移植，维持母体和胎儿间的免疫平衡是成功妊娠的关键，一旦这种平衡失调，可能导致滋养细胞的异常浸润、增殖，影响胎盘的正常形成和发育，从而诱发子痫前期等多种妊娠相关性疾病[11]。有研究[12]显示，子痫前期患者胎盘绒毛膜滋养细胞侵袭力降低，会使子宫内膜浸润不足，阻碍子宫螺旋动脉重铸，损伤全身血管内皮，全身及胎盘小动脉痉挛，微小血管助力增加，进而出现高血压、蛋白尿、水肿等表现。本研究显示，HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白在两组胎盘组织中均有表达，但两组HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白表达存在显著差异，提示HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白可以与子痫前期的发生和发展密切相关。

作为非经典HLA I类分子的HLA-G主要分布于母胎界面绒毛外细胞滋养层，可抑制T细胞和NK细胞活性，诱导T细胞凋亡，在调节滋养细胞浸润和维持母体间免疫耐受中发挥着重要的作用[13]。有研究[14-16]显示，采用免疫组化SP法测定HLA-G在子病前期患者胎盘组织的表达水平低于正常妊娠孕妇，可能是由于HLA-G低表达的滋养细胞，更易遭受母体免疫系统的攻击，不能有效侵入母体螺旋动脉，使胎儿动脉重铸过程受阻，不利于绒毛滋养细胞着床及血管发育，胎盘营养和氧气供应不足而引发病理妊娠。本研究显示，孕妇胎盘组织中HLA-G蛋白表达水平与Wnt5a和β-catenin蛋白表达水平均呈正相关，Wnt5a和β-catenin蛋白表达水平呈正相关，提示HLA-G蛋白表达水平与Wnt5a和β-catenin蛋白表达水平密切相关。目前，尚缺乏研究证实HLA-G低表达或表达缺陷是否会影响或引起Wnt5a和β-catenin蛋白信号表达通路的变化。本研究仅在组织水平上证实HLA-G蛋白表达水平与Wnt5a和β-catenin蛋白表达水平呈正相关，尚未行细胞学实验验证HLA-G、Wnt5a和β-catenin蛋白三者之间的相关分子机制或生物学行为变化。因此，今后可进一步通过动物或体外细胞实验探究HLA-G、Wnt5a和β-catenin蛋白三者之间的相互调控关系及对重症子痫前期母胎界面局部免疫系统和胎盘滋养细胞生物学行为的影响，以阐明子痫前期尤其是重症子痫前期的发病机制。

子痫前期的重要特征是胎盘滋养细胞侵袭不足和过度凋亡，其重要病理影响因素是氧化应激激活，但具体的调节机制还未阐明。一项细胞实验研究[17]表明，Wnt/β-catenin信号通路在细胞极性、增殖、凋亡等生命活动中起着重要的调控作用，通路激活可以减轻胎盘滋养细胞缺氧所致的损伤。李夏芳[18]研究报道，子痫前期胎盘组织中β-catenin蛋白含量明显低于健康孕产妇，表明β-catenin蛋白低表达使Wnt/β-catenin信号通路受到抑制，进而影响了滋养细胞的侵袭、凋亡及氧化应激，这一系列的变化可能与子痫前期的发生、发展密切相关。β-catenin蛋白是介导经典Wnt信号通路的一种多功能蛋白，兼具沉默和启动靶基因转录表达，调控细胞间信号转导和黏附连接，参与细胞骨架形成，在胚胎发育和着床、胎盘形成、血栓形成等妊娠各生理过程中起着调节作用[19]。据报道[20]，β-catenin蛋白水平降低会减弱人胎盘绒毛膜滋养层细胞HTR8/Svneo的侵袭能力，抑制Wnt/β-catenin信号通路，促进子痫前期的发展。本研究中的重度子痫前期患者胎盘组织中β-catenin蛋白表达水平低于正常妊娠孕妇，也进一步证明了β-catenin蛋白低表达与重度子痫前期的发生密切相关。

Wnt5a蛋白是Wnt家族的成员之一，也是介导非经典Wnt信号通路的一种重要蛋白，在胚胎的分化和发育以及调控滋养层细胞浸润过程中具有重要作用。一项体外细胞研究表明，人体子宫内膜基质细胞蜕膜化过程中，孕酮促进Wnt5a蛋白表达，与Wnt5a 蛋白受体结合，激活下游依赖cAMP的信号通路，促进锰超氧化物歧化酶(Mn-SOD)释放，进而减轻细胞氧化应激损伤。有研究[21]表明，子痫前期患者胎盘蜕膜组织中Wnt5a蛋白呈低水平表达，可能是由于滋养细胞浸润不足。Ujita等[22]研究表明，Wnt5a信号通路受损与胎盘形成不良和子痫前期密切相关。本研究中，重度子痫前期患者胎盘组织中Wnt5a 蛋白表达水平低于正常妊娠孕妇，表明Wnt5a蛋白低表达与重度子痫前期的发生密切相关。

本研究还显示，孕妇入院平均动脉压和尿蛋白水平与胎盘组织中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白表达均呈负相关，重症子痫组孕妇HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白水平降低，入院平均动脉压和尿蛋白水平较高。其机制可能是重症子痫孕妇HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白水平降低减弱了母胎免疫耐受程度和滋养细胞浸润能力，使胎盘着床浅，发生缺血缺氧，进而释放多种胎盘因子，损伤血管内皮细胞，从而导致孕妇血管平均动脉压升高，渗透压增大，尿蛋白含量增加。

综上所述，重度子痫前期孕妇胎盘组织中HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白的表达水平降低，低于正常妊娠孕妇，提示HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白可能参与重度子痫前期的发生和发展。今后可进一步探究和阐明HLA-G、Wnt5a、β-catenin蛋白在重度子痫前期进展中的具体发病机制，为临床靶向药物的研制提供参考依据。