miR-142-3p抑制甲状腺癌细胞增殖的研究

余明军，王海明

(杭州市第三人民医院 外科，浙江 杭州 310009)

甲状腺癌是常见的内分泌恶性肿瘤[1]，近年来发病率持续增长，为女性肿瘤发病率第1位，男性肿瘤发病率第2位[2]。大部分甲状腺癌在手术切除结合碘131及甲状腺素治疗后可达到临床治愈，但仍存在5%的5年复发率[3]。MicroRNA(miRNA)是一类长约21～25个核苷酸的小分子非编码RNA，在癌症的发生发展中扮演着重要角色。研究表明，miR-142-3p在宫颈癌、肾癌、急性白血病、非小细胞肺癌、结肠癌、肝细胞癌、鼻咽癌、骨肉瘤、食管癌、胰腺癌及乳腺癌等恶性肿瘤中均存在异常表达[4-8]，并且miR-142-3p可直接靶向细胞周期蛋白CDC25C，促癌基因HMGB1、TGFβR1，及多种干细胞表面特异分子如CD133、Lgr5、ABCG2，调控肿瘤细胞增殖、侵袭、周期、凋亡等。Jahanbani等[9]证实miR-142-3p在甲状腺癌组织中低表达。本研究检测甲状腺癌细胞及正常甲状腺细胞中miR-142-3p 的表达水平，研究miR-142-3p 对甲状腺癌细胞增殖能力、单克隆形成能力及细胞周期的影响，以期为甲状腺癌早期诊断、预测复发及寻找新治疗靶点提供思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 Real-time PCR 试剂盒购自上海欣百诺生物工程有限公司，RPMI1640 培养基、DMEM 培养基和胎牛血清购自美国Gibco公司，miR-142-3p mimics、miR-142-3p inhibitor、NC mimics购自上海吉玛制药技术有限公司，脂质体LipofectamineTM2000 购自美国Invitrogen 公司，MTT溶液、DMSO溶液、流式周期检测试剂盒购自美国Sigma公司，兔抗人Anti-Cyclin D1购自美国AbCam 公司，鼠抗人β-actin购自美国Epitomics公司，其他试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养 人甲状腺癌细胞K1、TPC-1、BCPAP和人甲状腺细胞Nthy-ori 3-1均购自中科院上海细胞库。K1细胞在含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10% FBS的DMEM培养基中培养，TPC-1、BCPAP和Nthy-ori 3-1细胞在含100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素、10% FBS的RPMI1640培养基中培养，于37℃、5% CO2、饱和湿度细胞培养箱中培养。

1.3 miR-142-3p的RT-PCR检测 根据说明书步骤操作，收集对数生长期的K1、TPC-1、BCPAP和Nthy-ori 3-1细胞，加入适量Triozl 细胞裂解液提取RNA，采用紫外分光光度计检测RNA的浓度及纯度，定量后用DEPC水稀释至500 ng/μL，合成cDNA。以GAPDH为内参，正向引物：5’CATGAGAAG TATGACAACAGCCT3’，反向引物：5’AGTCCTTCCAC GATACCAAAGTT3’；miR-142-3p上游引物为：5’ACA CTCCAGCTGGCTGTAGTGTTTCCTACT3’。miR-142-3p相对定量用2-△△CT计算。

1.4 细胞转染 取对数生长期的K1细胞接种于6 孔细胞培养板中，培养至细胞单层密度达到50%～60%时，按照LipofectamineTM2000脂质体转染试剂说明书步骤进行转染。阴性对照组(NC)、miR-142-3p mimics组和miR-142-3p inhibitor组分别转染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor，转染完成后继续培养。

1.5 MTT 实验 转染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor 24 h后，收集细胞接种于96孔细胞培养板中，初始细胞数为1 500个/孔，每组设置4个复孔。设置24、48、72、96、120 h 5个时间点。避光条件下，每孔加入MTT 溶液20 μL(5 mg/mL)孵育4 h后终止培养。负压吸引器小心吸去上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，摇床上低速振荡10 min使结晶充分溶解。酶联免疫检测仪检测各孔490 nm的吸光度(OD值)，计算平均值并绘制细胞增殖曲线。

1.6 克隆形成实验 转染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor 24 h后收集细胞，各组细胞按500个/孔接种于6孔板中，每组设置3个复孔。每孔补足完全培养基至1.5 mL，于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养7～10天，每2～3天更换新鲜培养基。当6孔板中出现肉眼可见的细胞克隆时终止培养，用PBS冲洗2次，95%乙醇固定10 min，通风处风干。0.1%结晶紫溶液染色20 min，冲洗风干后拍照。

1.7 流式细胞术检测细胞周期 转染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor 24 h后，用0.25%无EDTA的胰酶消化收集细胞，用PBS重悬离心后加入预冷的75%乙醇，4℃固定过夜。加入400 μL 0.05 g/L PI，室温避光孵育30 min后混匀，流式细胞仪上机检测。

1.8 Western blot实验 转染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor 48 h后收集细胞，加入80～100 μL裂解液，冰上裂解30 min后，12 000 rpm(离心半径13.5 cm)，4℃离心30 min。上清液蛋白定量后，加入5×loading buffer，沸水浴15 min使蛋白变性。样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后200 mA转膜1 h。硝酸纤维素膜蛋白面向上放入5%脱脂牛奶封闭液中，室温于摇床低速摇动，封闭1 h。加入一抗，4 ℃避光孵育过夜，一抗稀释倍数：Cyclin D1(1∶5 000)，β-actin(1∶1 000)。PBST洗涤NC膜后加二抗室温避光孵育2 h。PBST洗膜3次后，NC膜蛋白面朝下上机扫描，应用Odyssey 蛋白质分析成像系统显像，通过获取目的条带的灰度值作为表达强度。

1.9 统计学分析 应用 SPSS 22.0统计软件，计量资料比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-142-3p表达检测 RT-PCR结果显示，miR-142-3p在甲状腺癌细胞K1、TPC-1、BCPAP中的相对表达量分别为1.228±0.127、1.688±0.105、1.974±0.173，甲状腺细胞Nthy-ori 3-1中miR-142-3p的相对表达量为2.842±0.144。甲状腺癌细胞K1、TPC-1、BCPAP中的miR-142-3p相对表达量均低于甲状腺细胞Nthy-ori 3-1，差异均有统计学意义(P<0.05)。3种甲状腺癌细胞中K1 细胞的miR-142-3p表达量最低。见封三图1。

2.2 miR-142-3p对细胞增殖的影响 甲状腺癌细胞K1转染后24 h，NC组、miR-142-3p mimics组和miR-142-3p inhibitor组的OD值比较，差异无统计学意义(P>0.05)。从转染后48 h开始，3组细胞增殖能力开始出现差异。转染后120 h，与NC组OD值(0.820 5±0.025 5)相比，miR-142-3p mimics组细胞OD值(0.559 0±0.013 5)降低，miR-142-3p inhibitor组细胞OD值(1.116 5±0.029 3)增加，差异均有统计学意义(P<0.001)。见图1。

***与NC组比较，P<0.001。图1 miR-142-3p对甲状腺癌细胞K1增殖能力的影响Figure 1 Effect of miR-142-3p on proliferation of thyroid cancer cell line K1

2.3 miR-142-3p对细胞单克隆形成的影响 甲状腺癌细胞K1转染后，miR-142-3p mimics组细胞克隆形成少于NC组，且单个克隆小于NC组；miR-142-3p inhibitor组细胞克隆形成多于NC组，且单个克隆大于NC组。见封三图2。

2.4 miR-142-3p对细胞周期的影响 甲状腺癌细胞K1转染后，流式细胞术检测结果显示，NC组G0/G1期细胞百分比为(61.18±2.09)%，miR-142-3p mimics组G0/G1期细胞百分比为(74.89±2.09)%，miR-142-3p inhibitor组G0/G1期细胞百分比为(52.07±2.76)%，miR-142-3p mimic组G0/G1期细胞百分比高于NC组，miR-142-3p inhibitor组G0/G1期细胞百分比低于NC组，差异均有统计学意义(P<0.01)，见封三图3A。Western blot实验结果显示，与NC组相比，miR-142-3p mimics组Cyclin D1蛋白表达量下降，miR-142-3p inhibitor组Cyclin D1蛋白表达量升高，差异均有统计学意义(P<0.01)，见封三图3B。

3 讨论

研究表明，甲状腺癌组织中存在microRNA的差异表达[9-11]。甲状腺肿瘤microRNA表达谱的改变可作为生物学标志用于早期诊断，修复或抑制microRNA在甲状腺癌细胞中的表达有可能为开发抗肿瘤药物提供新思路。

现有研究[4-9]表明，miR-142-3p在包括甲状腺癌在内的多种癌症中表达下调，但其在甲状腺癌中的作用机制尚不明确。本研究采用RT-PCR检测人甲状腺癌细胞株和正常甲状腺细胞中miR-142-3p的表达水平，结果表明miR-142-3p在甲状腺癌细胞K1、TPC-1、BCPAP中表达明显降低，与Jahanbani等[9]研究结果相吻合，提示miR-142-3p在甲状腺癌细胞中发挥抑癌基因的作用。转染NC mimics、miR-142-3p mimics和miR-142-3p inhibitor的K1细胞经MTT 法及克隆形成实验检测，miR-142-3p mimics 组细胞增殖减慢，单克隆形成减少，而miR-142-3p inhibitor组细胞增殖增强、单克隆形成增加，说明高表达miR-142-3p可以明显抑制K1细胞的增殖能力。细胞周期实验及Western Blot对Cyclin D1蛋白的检测结果表明，外源性升高miR-142-3p的表达后，Cyclin D1表达被抑制，K1细胞被阻滞于G0/G1期。本研究结果提示，miR-142-3p在甲状腺癌中发挥抑癌基因的作用，通过抑制Cyclin D1的表达抑制细胞分裂，进而抑制细胞增殖，对癌细胞侵袭迁移能力的影响还有待进一步实验。

综上所述，miR-142-3p 在甲状腺癌细胞中呈低表达，高表达miR-142-3p可有效抑制甲状腺癌细胞的增殖能力，通过抑制Cyclin D1表达将细胞阻滞在G0/G1期。