解毒活血方治疗冠心病的网络药理学机制研究

刘素丽， 吴辉， 黄庞宁， 陈秋岑

（广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510405）

冠心病（coronary heart disease，CHD）已成为当前严重威胁人类健康最常见的心血管疾病之一。根据《中国心血管病报告2018》[1]数据显示，我国冠心病患者已逾1 100万，加强冠心病的中医药防治研究意义重大。冠心病属中医学“胸痹”“心痛”等病证范畴，其病位在心，涉及肝脾肾等脏，属本虚标实之证，本虚有气虚、阳虚、阴虚，标实有痰浊、血瘀、气滞、寒凝等[2]。“瘀毒”“毒瘀”病机理论是阐释冠心病发生发展的重要学说[3]。解毒活血方是广州中医药大学第一附属医院心血管科经验方，由黄芩、黄连、丹参、赤芍、川芎等中药组成，具有清热解毒、活血袪瘀功效。现代药理学研究表明，黄芩具有抗动脉粥样硬化、治疗冠心病的作用[4]；黄连具有抗炎、抗动脉粥样硬化、抗血小板聚集等作用[5]；丹参具有抑制血小板聚集、扩张血管、抗动脉粥样硬化、改善微循环等作用[6]；赤芍具有抗炎、抗凝、抗血栓等作用[7]；川芎具有减轻血管内皮损伤等作用[8]。可见，解毒活血方可从多重角度、多重作用途径治疗冠心病，但具体作用机制仍不明确。

网络药理学是通过数据挖掘及分析，探索中药方剂有效成分与疾病的关系、展现药物与疾病间作用机制的科学方法。因此，本研究运用网络药理学探讨解毒活血方治疗冠心病的作用机制，以期为该方的临床应用及进一步的药理作用机制研究提供理论依据和研究思路，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 解毒活血方活性成分及相应靶标的筛选 借助中药系统药理学分析平台（TCMSP）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），依次输入关键词“黄芩”“黄连”“丹参”“赤芍”“川芎”，检索收集解毒活血方的活性成分，以生物利用度（OB）＞30%且类药性（DL）＞0.18 为条件，筛选出利用度及活性偏高的有效活性成分；并从该数据库筛选出解毒活血方中所有中药对应的靶标，与已筛选出的活性成分进行对比，筛选出该活性成分对应的靶标。应用通用蛋白质数据库（UniProt）（http：// www.uniprot.org/uploadlists/），将获得的药物活性成分靶标进行通用名称注释。

1.2 冠心病靶标的收集及解毒活血方活性成分与冠心病共同作用靶标的获取 借助GeneCards 数据库（https：//www.genecards.org/）及在线人类孟德尔遗传（OMIM）数据库（https：//omim.org/），依次输入关键词“coronary heart disease”“CHD”，检索获得冠心病相关靶标，应用Venny 2.1 软件（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）绘制解毒活血方活性成分靶标与冠心病相关靶标关系的韦恩图。此交集中的靶标，即活性成分与冠心病共同作用的靶标。

1.3 构建解毒活血方治疗冠心病活性成分-共同作用靶标网络及共同作用靶标互作网络 借助Cytoscape 3.7.2 软件构建解毒活血方治疗冠心病活性成分-共同作用靶标网络，将其互作关系进行可视化。将共同作用靶标借助STRING数据库在线检索（物种设为“Homo sapiens”），绘制成靶标蛋白互作网络，获取蛋白互作信息，操作过程中将“minimum required interaction score”设为“highest confidence（0.900）”，并将“display simplifications”设为“hide disconnected nodes in the network”，其余参数保持默认设置。利用R 语言软件，根据靶标邻接节点的多少进行排序，获取核心作用靶点，选取数量排名前30 位的靶标，并以柱状图形式展现。

1.4 靶标的功能富集分析及相关通路的富集分析 借助R 语言利用Bioconductor 软件（http：//www.bioconductor.org/install/），将解毒活血方活性成分与冠心病共同作用的靶行基因本体论（GO）生物功能富集分析，以及京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析，并可视化。

2 结果

2.1 解毒活血方活性成分及相关靶点的筛选 借助TCMSP 数据库，以OB＞30%且DL＞0.18 为条件，筛选出解毒活血方中143 个活性成分，按OB大小降序排列，选取前20 个活性成分（见表1）列举，并筛选出以上143 个活性成分对应的相关靶标，且在UniProt 数据库中找到其相应靶标进行通用名注释（若未找到相应靶标，则删除），共220 个。

2.2 冠心病相关靶标收集及解毒活血方活性成分与冠心病共同作用靶标的获取 借助GeneCards、OMIM 数据库筛选冠心病相关靶点，共10 717 个，应用Venny 2.1 软件，绘制解毒活血方活性成分靶标与冠心病相关靶标关系的韦恩图（见图1），获得204个共同作用靶标。

2.3 构建解毒活血方治疗冠心病活性成分-共同作用靶标网络及共同作用靶标互作网络 借助Cytoscape 3.7.2 软件将143 个活性成分与204 个共同作用靶标的互作关系以网络图形式进行可视化（见图2），其中外圈三角形节点代表共同作用靶标，内圈正方形节点代表活性成分，中间菱形节点代表解毒活血方，圆形节点代表冠心病，边（节点之间的连线）代表节点之间的互作关系。从图2可见，一个活性成分可作用多个靶标，多个活性成分可作用一个靶标。

图1 解毒活血方活性成分靶标与冠心病相关靶标的韦恩图Figure 1 Venn diagram of the targets of the active ingredients of Removing Toxins to Activate Blood Recipe and the targets of coronary heart disease

图2 解毒活血方治疗冠心病活性成分-共同靶标互作网络Figure 2 Active ingredient-common target interaction network of Removing Toxins to Activate Blood Recipe

按照链接靶标数量降序排列，解毒活血方治疗冠心病前5位的活性成分主要有槲皮素、木犀草素、汉黄芩素、丹参酮iia、黄芩素等；按照链接活性成分数量降序排列，解毒活血方治疗冠心病前5 位的主要靶标有PTGS2、PTGS1、SCN5A、NCOA2、ADRB2。将共同作用靶标，借助STRING数据库，绘制靶标互作网络（见图3），共显示177 个靶标（数据库中未找到及离散的靶标均不显示），节点代表靶标，边代表靶标互作关系。

利用R 语言软件，根据靶标邻接节点的多少进行排序，获取核心靶标，选取数量排名前30 位的靶标，包括STAT3、JUN、AKT1、MAPK1、APP等，以柱状图（见图4）形式展现。

2.4 GO功能富集分析及KEGG通路的富集分析 借助R语言利用Bioconductor软件对共同靶点进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析，运行过程中以P＜0.05 为筛选条件。得到GO 分析结果184 个，选取前20位以气泡图（见图5）形式进行可视化。可见解毒活血方治疗冠心病的生物过程主要参与细胞因子受体结合、细胞因子活性、四吡咯结合、血红素结合、核受体的活性、G 蛋白偶联受体活性、氧化还原酶活性、抗氧化活性、类固醇激素受体活性、类固醇结合、肾上腺素能受体活性、儿茶酚胺结合等方面。

得到KEGG分析结果165个，选取前20位以气泡图（见图6）形式进行可视化。可见解毒活血方治疗冠心病的KEGG 通路有磷脂酰肌醇-3-羟激酶（PI3K）-苏氨酸激酶（Akt）信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、高级糖化终产物及其受体（AGE-RAGE）信号通路、白细胞介素17（IL-17）信号通路、低氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路等。

图3 共同作用靶标蛋白互作网络Figure 3 PPI network of the common targets

图4 邻接节点数排名前30位的核心靶标Figure 4 The top 30 targets based on the number of adjacent nodes

图5 解毒活血方对冠心病作用的前20位GO功能富集分析结果Figure 5 The top 20 of GO biological process enrichment analysis results for effects of Removing Toxins to Activate Blood Recipe on coronary heart disease

图6 解毒活血方对冠心病作用的前20位KEGG通路富集分析结果Figure 6 The top 20 of KEGG pathway enrichment analysis results for effects of Removing Toxins to Activate Blood Recipe on coronary heart disease

3 讨论

冠心病的主要病理基础是动脉粥样硬化，在目前有关动脉粥样硬化发病机制的学说中，炎症反应学说已得到公认[9]，炎症反应参与了动脉粥样硬化的发生、发展及斑块破裂、血栓形成等整个病理进程[10-12]。结合该炎症机制学说，本课题组针对动脉粥样硬化及冠心病提出了中医“毒瘀”病机学说。该学说认为，动脉粥样硬化发病机制中的各种致病因素如氧化低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）、毒性氧自由基、凝血/纤溶产物和炎性细胞因子等，相当于中医之“毒邪”，其损伤血管内皮并进入内膜而启动血管壁内的炎症反应，相当于“毒邪入侵”，“毒邪”稽留不去蕴久化热，可致毒结致瘀等病理改变，这些与炎症激活、斑块形成、斑块溃烂/出血、血栓形成等一系列病理改变相关联，此即“毒损脉络”之过程。在该病机学说指导下，本课题组以解毒活血方为基础，针对解毒活血法治疗冠心病的临床疗效及机制进行了许多有益探索：临床研究表明，运用解毒活血方治疗非ST 段抬高急性冠状动脉综合征（NSTEACS），可显著改善该类患者临床症状，下调血清CD40、核因子kappaB（NF-κB）的表达，提示解毒活血方治疗冠心病可能与其抗炎机制相关[13]；早期基础研究显示，解毒活血方可预防兔动脉粥样硬化易损斑块的形成，降低易损斑块内及血清TNF-α、细胞间黏附分子1（ICAM-1）表达，抑制易损斑块底部和肩部的炎症，调节血脂，从而稳定斑块[14-15]。基于此，进一步探索解毒活血方抗冠状动脉粥样硬化及稳定斑块的机制。

本研究结果显示，解毒活血方防治冠心病是多成分、多靶点、多机制的综合过程。根据GO及KEGG 富集分析结果，其生物过程与细胞因子受体结合、细胞因子活性、四吡咯结合、血红素结合、核受体的活性、氧化还原酶活性、抗氧化活性、类固醇激素受体活性、类固醇结合、G蛋白偶联受体活性、肾上腺素能受体活性、儿茶酚胺结合等密切相关，解毒活血方干预冠心病涉及的信号通路主要包括PI3K-Akt 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化、AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路等。结合文献发现：细胞因子有介导炎症、增加血小板数目及活性等作用，促进冠状动脉粥样硬化形成、增加粥样斑块的不稳定性、促进冠状动脉内血栓形成和痉挛等，与冠心病密切相关[16]；胆红素是一种具有天然抗氧化的四吡咯色素，血红蛋白的降解为其形成的主要途径，通过防止LDL-C的氧化修饰而防止动脉粥样硬化的形成[17]；核受体及其配体可参与调节血糖、血脂[18]，而血糖、血脂代谢异常是冠心病的独立危险因素；PI3K-Akt 通路与炎症介导、心肌细胞凋亡、血管内皮再生等有关，与冠心病关系密切相关[19]；流体剪切应力与动脉粥样硬化斑块的形成密切相关[20]；HIF-1能够引起内皮细胞功能障碍、增殖、血管生成和炎症，通过多种途径在动脉粥样硬化的发病机理中发挥作用[21]；AGE-RAGE 的激活可以诱导复杂的信号传导，从而导致炎症增加、氧化应激、钙沉积增加和血管平滑肌细胞凋亡增加，导致动脉粥样硬化的发展，AGE-RAGE 可能是通过这些机制成为冠心病发展的重要媒介[22]。

综上所述，我们认为解毒活血方治疗冠心病主要与其参与调控的炎症介质、动脉粥样硬化形成、血栓形成、血管内皮损伤、血管平滑肌收缩、调节心率等有关，尤其与参与调控细胞因子及PI3K-Akt 通路相关的炎症介导、动脉粥样硬化形成、血栓形成、血管内皮损伤等密切相关。而解毒活血方的应用进一步证实了“毒瘀互结”与冠心病的密切相关性，并证明了解毒活血法是用于治疗冠心病重要法则之一。另外值得关注的是，解毒活血方干预冠心病涉及的AGE-RAGE 信号通路在冠心病的病理生理机制中扮演着重要的角色，作为重要的心脏代谢危险因素[23]，因此我们提出在下一步应用解毒活血方对冠心病的防治研究中，对AGE-RAGE信号通路的研究应有所侧重。