血清miR-16-5p、 miR-17-5p和miR-330-3p联合检测对妊娠期糖尿病的诊断价值

兰 俊，杨健睿，张 军，邢雪梅

三二〇一医院医学检验科，陕西汉中 723000

妊娠期糖尿病是指任何程度的糖耐量不全，全世界的患病率正在增加，约7%的妊娠合并有糖尿病，其主要危险因素有先前的妊娠期糖尿病病史、孕妇年龄的增加和孕前肥胖等[1-2]。新近研究表明，微小RNA(miRNA)可作为多种疾病诊断、预后和治疗的生物标志物[3]。miRNA在细胞内和细胞外以无细胞循环形式存在于多种不同的生物体液中，包括血清或血浆[4]。这些miRNA可以与蛋白质结合(无囊泡)，也可以保留在膜状囊泡(如脱落的囊泡或外泌体)内部[5]。在许多疾病中，已发现miRNA在血液中异常表达，有证据表明，miRNA在病理过程中，特别是包装在外泌体上的细胞间通讯中具有潜在作用[6]。本研究检测妊娠期糖尿病患者和妊娠24～28周的健康孕妇血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p 3种miRNA的相对表达水平，探讨血清miRNA对妊娠期糖尿病的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年5—6月本院收治的妊娠期糖尿病患者10例(年龄22～29岁)和妊娠24～28周的健康孕妇10例(年龄23～29岁)，抽取静脉血行转录组测序技术(RNA-seq)检测。选择2018年5月至2020年5月本院收治的妊娠期糖尿病患者100例为观察组，年龄22～32岁，平均(26.12±2.14)岁。妊娠期糖尿病患者纳入标准：(1)符合妊娠期糖尿病诊断标准[7]；(2)宫内单活胎；(3)初产妇；(4)孕妇资料完整；(5)空腹血糖≥5.1 mmol/L或餐后1 h血糖≥10.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥8.5 mmol/L。另选择同期本院体检的妊娠24～28周健康孕妇100例为对照组，年龄22～33岁，平均(27.26±3.02)岁。排除标准：(1)严重心、肝、肾损伤；(2)服用过内分泌药物；(3)患有肿瘤；(4)患有精神疾病。观察组与对照组年龄、孕周等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经本院伦理委员会审批，受试者均签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1RNA-seq检测 选取10例妊娠期糖尿病患者和10例健康孕妇清晨肘前静脉血5 mL后使用Trizol法提取总RNA。RNA标本被送至北京基因组研究所(中国深圳)进行商业性RNA-Seq检测和数据分析。使用SOAPaligner/SOAP2不匹配，将干净的读段映射到Human数据库。计算每个基因的纯净读数数，然后将其标准化为每百万分之一读数(kbKM),该读数将读数数与基因相对表达水平相关联。

1.2.2RNA提取与实时荧光定量PCR检测 采集观察组和对照组孕妇的肘前静脉血5 mL。使用北京润泽康生物科技有限公司的miRNA提取试剂盒(货号：CW0627)进行血清总miRNA的提取。通过广州鲁诚生物科技有限公司的cDNA 合成试剂盒(货号：11117831001)进行cDNA第一链的合成。使用北京依珊汇通科技有限公司的实时荧光定量PCR试剂盒(货号：DEM202-50T)进行实时荧光定量PCR，检测2组受试者血清miR-16-5p、miR-17-5p、miR-330-3p的相对表达水平。以U48作为内参。3个指标为同一批标本分批检测，去除极大值和极小值保留其余数据。

2 结 果

2.1RNA-seq检测结果 RNA-seq检测结果显示，10例妊娠期糖尿病患者血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p的相对表达水平较10例健康孕妇高8倍以上。

2.2观察组与对照组血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p的相对表达水平比较 观察组血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p的相对表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 观察组与对照组血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p的相对表达水平比较

2.3miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p单独检测对妊娠期糖尿病的诊断价值 以病理结果患有妊娠期糖尿病的孕妇作为真阳性，未患有妊娠期糖尿病的孕妇为真阴性。ROC曲线结果显示，miR-16-5p单独检测诊断妊娠期糖尿病的ROC曲线下面积(AUC)为0.95±0.02(95%CI:0.910 5～0.983 5，P<0.001)，当miR-16-5p的阳性临界值为8.842时，其灵敏度为95%，特异度为95%。miR-17-5p单独检测诊断妊娠期糖尿病的AUC为0.97±0.01(95%CI:0.944 6～0.992 2，P<0.001)，当miR-17-5p阳性临界值为36.000时，其灵敏度为97%，特异度为96%。miR-330-3pp单独检测诊断妊娠期糖尿病的AUC为0.94±0.02(95%CI：0.915 1～0.983 7,P<0.001)，当miR-330-3p的阳性临界值为2.916时，其灵敏度为94%，特异度为95%。见表2。

2.4血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p联合检测对妊娠期糖尿病的诊断价值 以miR-16-5p的阳性临界值为8.842、miR-17-5p的阳性临界值为36.000、miR-330-3p的阳性临界值为2.916作为诊断标准进行联合诊断，三者满足其中之一为阳性定义为联合诊断阳性，反之则为联合诊断阴性。血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p联合检测诊断妊娠期糖尿病的灵敏度为98%，特异度为93%，准确性为96%。见表3。

表2 miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p单独检测对妊娠期糖尿病的诊断效能

表3 血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p联合检测对妊娠期糖尿病的诊断四格表(n)

3 讨 论

β细胞对外周胰岛素抵抗的适应能力不足，是妊娠中晚期的特征，可能也是妊娠期糖尿病的主要原因，但对这种失败的分子机制研究尚不明确[6,8]。在正常妊娠期间，与β细胞肥大和(或)增生相关的胰岛素分泌的补偿性增加可维持葡萄糖稳态，推测胎盘激素等几种分子在这些适应性改变中起着核心作用，促进β细胞必需的基因表达变化，从而满足补偿要求[9-10]。此外，这种补偿现象涉及在这些信号分子下游起作用的几种特定的β细胞因子，如转录因子MafA和(或)PDX1，它们的表达增强使β细胞表型得以维持[11]。

miRNA是内源性的19～24 nt小非编码RNA，在基因表达的调节中起重要作用。有研究评估了血清miRNA在糖尿病中的表达，表明miRNA为该组慢性代谢疾病的早期生物标志物[12]。事实上，血清中的miRNA与β细胞的质量、功能及免疫系统的稳态有关，其无疑是糖尿病发病机制的主要参与者[11]。关于妊娠期糖尿病，缺乏定义血清miRNA的表达和诊断用途的数据，对miRNA功能的理解可以提高对妊娠期糖尿病的病因和病理生理的了解，可比目前的方法更早地诊断妊娠期糖尿病。在本研究中，通过RNA-seq检测10例妊娠期糖尿病患者和10例妊娠24～28周的健康孕妇中的miRNA相对表达水平，发现妊娠期糖尿病患者血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p的相对表达水平较健康孕妇高8倍以上。miR-16-5p直接靶向血管内皮生长因子A，该物质已被广泛报道为妊娠期糖尿病的关键介质，并参与内皮细胞的内源性血管生成[13]。糖尿病的巨噬细胞条件培养基降低p21Cip1和p27Kip1的表达，增加miR-17-5p的表达并诱导平滑肌细胞增殖，表明miR-17-5p在糖尿病患者的血管并发症中起关键作用[14]。SEBASTIANI等[15]研究发现，血清miR-330-3p可能通过下调AGTR2表达来抑制胰腺内分泌或胰腺β细胞新生，从而引起高代谢需求期间内分泌胰腺再生能力的缺陷。

本研究结果显示，观察组患者血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p的相对表达水平均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。实际上，通过与mRNA非翻译区域中的部分互补位点进行碱基配对，miRNA可以负调控这些分子的表达和翻译，是基因表达调控的关键因素[12]。在本研究中，血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p单独检测诊断妊娠期糖尿病的灵敏度分别为95%、97%、94%，特异度分别为95%、96%、95%。血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p联合检测诊断妊娠期糖尿病的灵敏度为98%，特异度为93%，准确性为96%。每个miRNA都可能调节多个基因，而一个miRNA可以靶向单个基因[16]。有研究证明，miRNA在健康和糖尿病条件下及怀孕期间的β细胞代偿过程中都参与β细胞功能和分化的多方面[17]。

综上所述，血清miR-16-5p、miR-17-5p和miR-330-3p可能参与妊娠期糖尿病的发生、发展。