血清miR-33a、miR-29c、miR-126联合检测对脑动脉粥样硬化的诊断价值

何 麟，陈 忠，赵春勤，张浩春，邓功建，董先成

达州市中心医院：1.脑血管病及介入治疗科；2.泌尿外科，四川达州 635000

缺血性卒中的特点是高发病率和高病死率[1]。80%的缺血性卒中是由动脉粥样硬化造成的动脉闭塞或狭窄引起的[2]。动脉粥样硬化是由高脂血症伴随的血管壁慢性炎症所致，这种炎症由多种细胞类型引发，如内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞[3]。微小RNA(miRNA)是内源性非编码单链RNA，可通过识别位于mRNA靶标3′非翻译区(3′UTR)的结合位点来调节基因表达，参与多种生物学功能[4-5]。血清中的miRNA常作为各种疾病的潜在生物标志物，如大肠癌、心肌梗死和急性粒细胞性白血病[6]。已有研究显示，脑动脉粥样硬化患者血清miR-33a、miR-29c、miR-126的表达失调[7-9]。本研究主要探讨血清miR-33a、miR-29c、miR-126联合检测对脑动脉粥样硬化的诊断价值。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2018年1月至2020年1月在本院收治的脑动脉粥样硬化患者120例为研究组，其中男54例，女66例，平均年龄(61.4±11.3)岁。脑动脉粥样硬化是指脑动脉狭窄明显(≥50%)，所有患者均接受CT和(或)核磁共振、脑多普勒超声、脑部超声、脑部磁共振脑血管成像、CT血管造影或数字减影血管造影、心脏超声检查或其他检查，以识别脑血管疾病和心脏病。排除患有确定或不确定病因、严重心脏病、近期心肌梗死或心绞痛疾病、严重感染、严重肾病或肝病、血栓性疾病或患有心脏栓塞性卒中的患者。根据动脉粥样硬化(≥50%)时闭塞的动脉数量确定脑动脉粥样硬化的严重程度，并将研究组分为单动脉组(23例)、双动脉组(53例)和多动脉组(44例)。另选择同期体检健康者120例为对照组，其中男60例，女60例，平均年龄(60.5±14.2)岁。研究组和对照组性别、年龄等一般资料比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究得到本院伦理委员会的批准，并获得所有参与者的知情同意。

1.2RNA提取与实时荧光定量PCR(qPCR) 2组受试者清晨抽取静脉血3 mL。将标本储存在未装有任何抗凝剂的试管中，4 ℃静置过夜，之后在室温下以3 000 r/min的速度离心10 min，取上清液即为血清。将血清小心地转移至Eppendorf管中，并保存至-80 ℃直至进一步处理。使用Trizol LS试剂从400 μL血清中提取总RNA (Takara，中国大连)。使用PrimeScript®miRNA cDNA合成试剂盒(Takara,日本) 反转录成cDNA。qPCR采用RotorGENE-3000和RotorGene6 qPCR检测系统(Corbett Research America)一步法进行3个重复。所有miRNA引物均购自大连Takara公司。miRNA表达正常化为小核仁RNA U6。

2 结 果

2.1研究组与对照组血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相对表达水平比较 血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相对表达水平在研究组明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 研究组与对照组血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相对表达水平比较

2.2血清miR-33a、miR-29c、miR-126单项或联合检测对脑动脉粥样硬化的诊断价值分析 ROC曲线分析结果显示，miR-33a单项检测对脑动脉粥样硬化诊断的ROC曲线下面积为0.95±0.02(95%CI=0.918 6～0.981 9)，当miR-33a的阳性临界值为0.882 6，其诊断灵敏度为95.00%，特异度为95.00%。miR-29c单项检测对脑动脉粥样硬化诊断的ROC曲线下面积为0.93±0.02(95%CI=0.887 8～0.965 0)，当miR-29c的阳性临界值为1.143 0，其诊断灵敏度为93.00%，特异度为92.00%。miR-126单项检测对脑动脉粥样硬化诊断的ROC曲线下面积为0.91±0.02(95%CI=0.871 6～0.955 3)，当miR-126的阳性临界值为1.406 0，其诊断灵敏度为92.00%，特异度为91.00%。

将患有脑动脉粥样硬化的定义为真阳性，未患有脑动脉粥样硬化的为真阴性。以miR-33a的阳性临界值0.882 6、miR-29c的阳性临界值1.143 0、miR-126的阳性临界值1.406 0为诊断界限，三者满足其一者为联合诊断阳性。血清miR-33a、miR-29c、miR-126联合检测对脑动脉粥样硬化诊断的灵敏度为96.67%，特异度为90.00%，准确度为93.33%。见表2。

2.3血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同脑动脉粥样硬化严重程度患者中的相对表达水平 血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同脑动脉粥样硬化严重程度患者中的相对表达水平差异有统计学意义(P<0.05)；且单动脉组患者的相对表达水平均低于双动脉组，双动脉组患者的表达水平均低于多动脉组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 血清miR-33a、miR-29c、miR-126联合检测对脑动脉粥样硬化的诊断四格表(n)

表3 血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同脑动脉粥样硬化严重程度患者中的相对表达水平

3 讨 论

脑动脉粥样硬化是缺血性卒中的最重要机制[10]。然而，目前尚未发现评估脑动脉粥样硬化的特异性血清生物标志物[11-12]。在本研究中，血清miR-33a、miR-29c、miR-126单项检测诊断脑动脉粥样硬化的灵敏度分别为95.00%、93.00%、92.00%，特异度分别为95.00%、92.00%、91.00%。miRNA以高度稳定的形式存在于循环系统中,它们对核糖核酸酶、冻融循环和其他剧烈的实验条件具有抵抗力[13-14]。血清样品可以在-20 ℃或-80 ℃的温度下保存数月，而不会显著降解miRNA[15]。因此，miRNA被认为是理想的候选生物标志物。本研究结果显示，血清miR-33a、miR-29c、miR-126联合检测对脑动脉粥样硬化的诊断灵敏度为96.67%，特异度为90.00%，准确度为93.33%，显示了较好的诊断效能。

本研究结果显示，血清miR-33a、miR-29c、miR-126的相对表达水平在研究组和对照组差异有统计学意义(P<0.05)；血清miR-33a、miR-29c、miR-126在不同脑动脉粥样硬化严重程度患者中的相对表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。表明血清miRNA是由于发生缺血性卒中后，从受损或循环的脑细胞释放而增加的，这与MAYR等[16]的早期研究结果一致。炎症和免疫反应在动脉粥样硬化的发生和发展中起关键作用[17]，miR-126的上调抑制了血管细胞黏附分子-1和肿瘤坏死因子α的表达，限制了白细胞对内皮的黏附，减少了与动脉粥样硬化过程有关的炎性反应[18]。以往研究表明，miR-29c通过调节编码细胞外基质蛋白(如胶原蛋白A和3A)的miRNA靶标来调节脑动脉粥样硬化[19]。由miR-33a和miR-33b组成的miR-33家族是miRNA介导的脂质代谢调控最典型的miRNA之一，而脂质代谢异常是动脉粥样硬化的基础[20]。巨噬细胞特异性miR-33的丢失减少了高脂血症条件下的脂质蓄积和炎症，从而减少斑块负担，缓解动脉粥样硬化[5]。抗miR-33治疗是降低动脉粥样硬化的潜在治疗手段。但是，研究组血清miR-33a、miR-29c、miR-126相对表达水平升高的原因尚不清楚。血清中的miRNA可能主要是由病变细胞释放的，因此，在细胞受伤或变性时会增加，这间接表明miR-33a、miR-29c、miR-126在脑血管系统正常发育中起重要作用。

综上所述，血清miR-33a、miR-29c、miR-126可作为联合诊断脑动脉粥样硬化的潜在生物标志物。