血清miR-21、sICAM-1和CA153联合检测对乳腺癌的早期诊断价值*

汪晓曼，朱怡恬，叶莉莉，苏亚娟

1.南京医科大学附属妇产医院/南京市妇幼保健院检验科,江苏南京 210009;2.哈尔滨医科大学附属肿瘤医院检验科,黑龙江哈尔滨 150081

乳腺癌是严重威胁女性健康的常见恶性肿瘤，全世界每年新增病例约138万，近年其发病率呈逐年升高的趋势，世界卫生组织公布的统计数据显示，乳腺癌已成为全球女性的首发恶性肿瘤[1]。文献报道，早期乳腺癌预后较好，但晚期乳腺癌因发生淋巴结和血行转移，预后较差，因此，乳腺癌的早期诊断对提高乳腺癌的疗效、改善预后具有重要意义[2-3]。乳腺癌的诊断临床常采用活组织检测，但因其具有侵入性、存在取样误差和患者依从性差等缺点难以开展[4]。目前血清肿瘤标志物的检测已成为乳腺癌早期诊断的重要辅助手段之一，受到临床的广泛重视，且每一种肿瘤标志物都有其独特的优势和局限性，合理利用能优势互补，提高乳腺癌的诊断率[5]。本研究对血清中非编码小RNA分子miR-21、可溶性细胞间黏附分子1(sICAM-1)和糖类抗原153(CA153)联合检测在乳腺癌早期诊断中的应用价值进行探讨，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2019年12月在南京医科大学附属妇产医院诊断为乳腺癌的患者31例作为恶性肿瘤组，年龄35～77岁，平均(53.13±4.65)岁，术后病理TNM分期：Ⅰ期7例，Ⅱ期9例，Ⅲ期13例，Ⅸ期2例。选择同期在南京医科大学附属妇产医院活组织检测为乳房良性病变患者31例作为良性肿瘤组，年龄37～79岁，平均(54.16±4.92)岁；选择同期在南京医科大学附属妇产医院体检健康者31例作为健康对照组，年龄36～76岁，平均(52.48±5.27)岁。3组受试者一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。所有受试者均签署知情同意书，本研究经南京医科大学附属妇产医院伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 血清CA153检测采用瑞士罗氏e601电化学发光微粒子仪及匹配的试剂，以上项目通过室间质评及性能验证；血清sICAM-1检测试剂盒由CUSABIO公司提供。RNA提取试剂盒由美国Invitrogen公司提供，SYBR Green荧光染料试剂盒购自瑞士罗氏公司，PCR引物由上海昕浩生物设计、合成。

1.3方法

1.3.1血清标本的分离 所有患者抽取空腹静脉血5 mL，室温静置20 min，以3 000 r/min离心20 min进行血清分离，于-20 ℃冰箱保存，所有标本避免脂血、溶血和黄疸。

1.3.2血清CA153和sICAM-1检测 血清CA153的检测采用电化学发光微粒子法，血清sICAM-1的检测采用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法。以上各指标的检测均严格按照试剂说明书及《全国临床检验操作规程》第4版[6]进行。

1.3.3血清miR-21检测 采用实时荧光定量PCR，通过标准曲线计算血清miR-21水平。采用苯酚氯仿法提取血清中总RNA，反转录成cDNA，采用SYBR Green法检测血清miR-21水平，上游引物5′-TGC GGT AGC TTA TCA GAC TG-3′，下游引物5′-CCA GTG CAG GGT CCG AGG T-3′。反应体系：MgCl21.20 μL，PCR缓冲液2.00 μL，dNTPs (10 mmol/L) 0.40 μL,Taq酶0.30 μL，探针和引物0.33 μL，cDNA 1.00 μL，加ddH2O至总反应体积20.00 μL。反应条件：94 ℃ 15 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。每个样品设3个复孔，同时以ddH2O 设为阴性对照。

1.3.4计算公式 灵敏度=真阳性/(真阳性+假阴性)×100%，特异度=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%，阴性预测值=真阴性/(真阴性+假阳性)×100%，阳性预测值=真阳性/(真阳性+假阳性)×100%，诊断效率=真阳性+真阴性/(真阳性+假阳性+真阴性+假阴性)×100%。

2 结 果

2.13组血清miR-21、sICAM-1、CA153水平比较 血清miR-21、sICAM-1、CA153水平在良性肿瘤组与健康对照组比较，差异无统计学意义(t=1.261、1.319、1.685，均P>0.05)；血清miR-21、sICAM-1、CA153水平在恶性肿瘤组明显高于良性肿瘤组，差异有统计学意义(t=2.876、2.651、5.394，均P<0.05)。见表1。

表1 3组血清miR-21、sICAM-1、CA153水平比较

2.23种生物学标志物单项或联合检测对乳腺癌的早期诊断效能 本研究数据显示，血清miR-21、sICAM-1、CA153联合检测早期诊断乳腺癌的灵敏度、阳性预测值和诊断效率与miR-21单项检测比较，差异有统计学意义(χ2=5.383、6.653、4.391，均P<0.05)；血清miR-21、sICAM-1、CA153联合检测早期诊断乳腺癌的灵敏度、阴性预测值、阳性预测值和诊断效率与sICAM-1单项检测比较，差异有统计学意义(χ2=7.715、4.310、5.922、4.257，均P<0.05)；血清miR-21、sICAM-1、CA153联合检测早期诊断乳腺癌的灵敏度、特异度、阴性预测值、阳性预测值和诊断效率与CA153单项检测比较，差异有统计学意义(χ2=7.715、6.945、5.107、12.37、7.461，均P<0.05)。见表2。

分别绘制血清miR-21、sICAM-1、CA153单项和联合检测对乳腺癌早期诊断的ROC曲线，结果显示，miR-21、sICAM-1、CA153单项检测早期诊断乳腺癌的ROC曲线下面积分别为0.739(95%CI：0.604～0.874)、0.723(95%CI：0.591～0.854)、0.767(95%CI：0.633～0.902)，而血清miR-21、sICAM-1、CA153联合检测早期诊断乳腺癌的ROC曲线下面积为0.891(95%CI：0.792～0.991)。见图1。

表2 3种生物学标志物单项或联合检测对乳腺癌的早期诊断效能(%)

图1 血清miR-21、sICAM-1、CA153单项和联合检测早期诊断乳腺癌的ROC曲线

3 讨 论

近年来随着生命科学技术的迅猛发展，一类在进化上高度保守、在基因转录后水平实现负向调控基因的miRNA的研究在各个领域最为活跃，极大拓宽了人们对生物发育、疾病发生、发展的认识[7]。在哺乳动物基因组中，成熟的miRNA基因调控着超过30%的基因表达或蛋白合成[8]，因此,miRNA 在不同疾病及病理进程中具有特定的表达谱，已经在多种肿瘤、自身免疫性疾病、炎症等多种疾病的诊断和预后中显示了重要价值[9]。miRNA不仅在组织中稳定表达，并且在血清中具有较高的稳定性和特异度，因此，有望成为早期诊断肿瘤的无创新型生物学标志物[10]。

多种恶性癌组织中miRNA的表达与肿瘤的发生、发展密切相关，miR-21作为miRNA中研究的热门原癌基因，被视为一种理想的肿瘤生物学标志物[11]。miR-21已被发现在多种血液系统和实体器官的恶性肿瘤中发挥重要作用，是目前唯一发现的在肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌和食管癌中均高表达的miRNA，也是第一个可以在肿瘤患者血清中检测到的miRNA，因此，在miRNA的研究领域中，miR-21的作用不容忽视[12]。文献报道显示，miR-21在乳腺癌早期患者血清中显著升高，提示miR-21在乳腺癌的早期诊断中具有一定的临床价值，且相对于早期乳腺癌患者，晚期患者miR-21升高更为显著，因此，miR-21与乳腺癌的临床分期密切相关[13]。本研究结果显示，miR-21在恶性肿瘤组均明显高于良性肿瘤组。但基于miR-21表达具有广谱性，将miR-21单项检测用于乳腺癌早期诊断，特异度较低，因此，本研究将miR-21与sICAM-1、CA153联合检测，以提高临床对于乳腺癌早期诊断的特异度。sICAM-1作为介导细胞间黏附的黏附分子，与其配体结合可介导肿瘤细胞与不同细胞、基质的黏附，以此促进肿瘤的侵袭和转移。研究显示，sICAM-1在肝癌组织中表达显著增加，水平与肿瘤的大小、包膜的完整性密切相关，且有转移组sICAM-1水平显著高于无转移组，sICAM-1已作为预测肝癌转移、复发和预后的重要生物学指标[14]。亦有研究发现，sICAM-1在乳腺癌组织中的表达强度和阳性率明显高于相应的正常乳腺组织[15]，与本研究对sICAM的检测结果高度一致，提示本研究选择将sICAM-1作为乳腺癌早期诊断的指标之一切实可行。CA153作为公认的乳腺癌相关抗原，不仅用于乳腺癌的监测和筛查，还可作为乳腺癌骨转移及预后的标志物[16]，但单独将CA153作为乳腺癌早期诊断的标志物尚存在片面性。因此，本研究将血清miR-21、sICAM-1、CA153联合检测用于乳腺癌的早期诊断，其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、诊断效率较单项检测均显著提高，分别为87.1%、90.3%、93.3%、81.8%、89.2%，且联合检测早期诊断乳腺癌的ROC曲线下面积为0.891，说明联合检测对乳腺癌的早期诊断有重要临床价值。本研究不足之处在于纳入的样本量相对较少，后续研究中，将采取前瞻性研究，扩大临床样本量，进一步确定适合本地区特色的乳腺癌早期诊断模式。