全血铁和铜与心血管疾病关联的基于队列的病例对照研究

黄 仙，吴寿岭，陈朔华，孙园园，张 迪，郭淑霞*，王 丽*

(1.石河子大学 医学院 预防医学系，新疆 石河子 832000；2.中国医学科学院基础医学研究所北京协和医学院基础学院 流行病与卫生统计学系，北京 100005；3.开滦总医院 心内科，河北 唐山 063000； 4.开滦(集团)公司 员工健康保障中心，河北 唐山 063000)

心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)是导致包括中国在内的全球死亡的首要原因[1]。控制CVD的危险因素，尤其是可控的危险因素，从而最终实现CVD的预防和控制是中国乃至全球面临的重要公共卫生问题之一。目前已确定的CVD危险因素包括高血压、高血脂、吸烟、肥胖及糖尿病等[2-3]。近年来，微量元素对心血管健康的影响逐渐被关注。研究显示，人体微量元素的不平衡可能导致CVD的发生风险增加，但结论仍然存在不一致[4]。因此，本研究拟基于开滦队列人群开展病例-对照研究，探讨全血铁、铜及其交互作用与CVD的发生风险关联。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究是以开滦队列人群为基础的病例对照研究(cohort-based case control study)。开滦队列始建立于2006年，以河北省开滦集团所辖的11家医院的所有职工体检人群为研究对象，每两年随访一次。本研究病例选自2017-08-01至2018-05-31，在该集团所辖的林西医院、马家沟医院和荆各庄医院3家医院随访，且经诊断为CVD的93例男性；其中CVD的诊断标准分别遵循美国心脏病学院和美国心脏协会(ACC/AHA)2009年修订的心肌梗死治疗指南[5]和1989年世界卫生组织(WHO)针对卒中提出的标准诊断[6]。对照组选自同期相同医院随访的无CVD男性，与病例组按照年龄(±5岁)和职业(体力劳动、脑力劳动)进行1∶4的个体匹配，共372名对照。本研究排除了受微量元素潜在影响的疾病，如癌和帕金森病。本研究已经通过开滦集团有限公司医院医学伦理委员会批准；此研究经开滦集团和中国医学科学院伦理委员会批准(批准号：2018ZX10715005)，并取得所有涉及此项研究对象的知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 资料收集及指标测量：由统一培训的医生和护士按照统一的标准，通过问卷调查、体格检查和实验室检查收集信息。问卷调查包括年龄、性别、职业、吸烟、饮酒史、病史(高血压、糖尿病等)等。体格检查包括身高、体质量、腰围、臀围和血压等的测量，并根据体质量(kg)/身高2(m2)计算体质指数(body mass index, BMI)。 常规实验室检查包括血生化(血红蛋白等)和血常规(三酰甘油、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、空腹血糖和高敏C反应蛋白等)。所有受检者收集静脉血标本前均空腹≥8 h，采用日立7600自动化分析仪测定血常规和血生化指标。同时采用电感耦合等离子质谱仪分析方法检测全血中铁和铜含量，具体的方法为：全血样品经0.5%硝酸稀释、混匀、离心后，取上清液，再次经0.5%硝酸稀释、混匀，作为待测溶液样品。分别取铜和铁标准品，以0.5%硝酸逐级稀释为工作标准溶液。将工作标准溶液系列样品和待测溶液样品依次上机，同时加入内标混合溶液，建立内标校正标准曲线法以定量分析血铁和血铜浓度。采用混合人全血样品作为质控样品，跟随每个批次进行检测。

1.2.2 相关变量的定义以及诊断标准：吸烟定义为每天至少吸1支烟并且连续吸烟超过1年。饮酒定义为过去一年内至少饮酒12次及以上。高血压定义为收缩压≥140 mmHg或舒张压≥90 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，或正在服用高血压降压药物，或自我报告有高血压患病史[7]。糖尿病定义为空腹血糖≥7.0 mmol/L，或有降血糖用药史，或自我报告糖尿病患病史[8]。高血脂症定义为总胆固醇≥5.2 mmol/L或三酰甘油≥1.70 mmol/L或高密度脂蛋白胆固醇<1.0 mmol/L或低密度脂蛋白胆固醇≥3.4 mmol/L[9]；BMI≥24 kg/m2定义为超重或肥胖[10]；贫血定义为血红蛋白<130 g/L[11]。

1.3 统计学分析

在探讨全血铁、全血铜与CVD的单独效应时，首先基于限制性立方样条函数确定全血铁和血铜与CVD的关系，并将其作为全血铁和血铜的分组依据；之后采用3个条件logistic回归模型分别探讨全血铁和全血铜与CVD之间的风险关联：模型1校正年龄；模型2校正年龄、吸烟、饮酒、超重；模型3进一步校正高血压、糖尿病、高血脂症、贫血和高敏C反应蛋白。

进一步探究全血铁和血铜共暴露与CVD的效应。首先，将所有金属浓度进行Z转换，采用自适应弹性网络回归(Adaptive Elastic-net, AENET)模型[12]对全血铁和血铜的线性项、平方项以及二者的交互项进行筛选，惩罚系数根据5-折交叉验证法得到，选择最小预测误差的参数作为最终纳入的惩罚系数；使用AENET模型中保留的与CVD关系密切的金属项构建环境风险评分(Environmental Risk Score, ERS)代表全血铁和血铜对CVD的综合效应。ERS计算公式如下：

所有数据分析均采用SAS9.4版和R3.6.1版软件完成。

2 结果

2.1 研究人群基本特征

研究对象特征如表1所示，病例组的平均年龄为(61.3±7.9)岁，对照组为(61.0±7.5)岁。与对照组相比，CVD组人群超重、糖尿病、高血压和贫血的比例以及高敏C反应蛋白水平均偏高(P<0.05)。但两组人群在吸烟、饮酒和高血脂症等的分布上无显著差异无统计学意义。

表1 研究人群特征分布Table 1 Characteristics of the participants

2.2 病例组和对照组人群全血铁和全血铜浓度的分布

CVD组全血铁浓度显著高于对照组[(576.06±103.78)μg/mLvs. (480.60±100.53)μg/mL]，而血铜浓度显著低于对照人群(0.54±0.10)μg/mLvs. (0.63±0.12)μg/mL(P<0.001)。Spearman 相关分析结果显示，全血铁和血铜存在负相关关系(相关系数r=-0.334，P<0.001)(图1，表1)。

*P<0.01 compared with control图1 全血铁和血铜浓度在病例组和对照组人群中的分布Fig 1 Blood iron and copper concentrations in case and control n=93/372)

2.3 全血铁和血铜与CVD

限制性立方样条(restricted cubic spline,RCS)回归分析显示，全血铁浓度与CVD呈现正向线性关系(线性检验P<0.001)；全血铜浓度与CVD之间呈现反向的非线性关系(非线性检验P<0.001)(图2)。

Knots were placed at the 5th, 35th, 65th and 95th percentiles of the blood metal distribution, and the reference values were set at the median of the control group (blood iron: 490.58 μg/mL; copper:0.605 μg/mL).Models were adjusted for age, smoking, drinking, overweight, hypertension, diabetes, hyperlipidemia, anemia and hs-CRP图2 全血铁(A)和血铜(B)与CVD的限制性立方样条曲线Fig 2 Restricted cubic spline curves for association of blood iron (A), blood copper (B) and cardiovascular diseases

根据样条图结果，全血铁以对照组的中位值(490.58 μg/mL)分为低血铁组和高血铁组，全血铜根据对照人群的75分位数(0.684 μg/mL)分为低血铜组和高血铜组，分别构建条件logistic回归。结果显示(表2)：对于全血铁3个模型均表现出高血铁组人群的CVD发生风险较低血铁组增加(P<0.001)；而对于全血铜，低血铜组发生CVD的风险较高血铜组增加(P<0.01)。

表2 全血铁、铜与心血管疾病风险关Table 2 Associations between blood iron, copper and cardiovascular diseases

2.4 全血铁和血铜危险评分与CVD

全血铁、铜的线性项、平方项及其交互作用均被保留在AENET模型中(表3)。基于上述模型分别计算每个病例和对照的环境风险评分ERS， ERS范围为-2.683～3.608， 中位值为0.081。随着铁浓度的增加，ERS值表现为先升高后降低；而ERS值随铜的浓度增加，则先降低后升高。进一步采用ROC曲线分析ERS与CVD的关系，结果提示当临界值为0.232时ERS对于CVD的预测价值更好。因此以ERS≤0.232为参照组，分别采用单因素及多因素模型探讨ERS评分与CVD的关联(表4)，结果均提示随着ERS评分的增加，发生CVD的风险增加。

表3 选择在自适应弹性网络回归的血液金属预测因子Table 3 Selected blood metal predictors in Adaptive Elastic-net regression*

表4 基于条件logistic回归的ERS与CVD关联分析Table 4 Conditional logistic regression analysis of the association between ERS and CVD

3 讨论

本研究通过开展以队列为基础的病例对照研究，发现较高的铁储量和铜缺乏是CVD的独立风险因素；同时基于AENET模型构建铁和铜的共暴露评分，发现ERS值越高，CVD的发生风险越高。

1981年，Sullivan提出“铁假说”，认为随人体铁储量不断蓄积，CVD的发生风险相应增加[13]。本研究同样支持这个假说，发现高铁水平会增加CVD的发生风险。其发生机制与氧化应激有关，即当人体铁含量较高时，可参与Fenton反应生成大量的氧化自由基，进而诱导动脉粥样硬化的发生[14]。然而部分研究得到相反的结论[15-16]。中国一项病例对照研究[15]发现，在校正BMI、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病和高血脂症后，与最低四分位数组比较，最高四分位数者发生CVD的风险减低41%(95%CI: 0.40～0.89)。

本研究还发现铜缺乏可能与CVD的风险增加有关。这与Karis[17]等的研究结果一致。研究表明，铜缺乏会降低SOD水平，导致NO下降及氧化应激的增加[18]。而一项前瞻性队列研究发现了相反的现象，在校正年龄和性别后，血清铜最高四分位数组CVD的死亡风险是最低组的2.58倍(95%CI: 2.05-3.25)[19]。

考虑到金属元素之间可能存在较强的相关性，本研究进一步探讨了铁和铜共暴露时对CVD的影响。结果发现二者不仅存在单独效应，也存在负向交互作用。动物实验中也证实了二者之间的竞争作用。有研究显示，高铁饮食喂养大鼠导致其心脏肥大，贫血，血清和组织中铜水平的降低，而通过补充铜能够逆转血清铜和铜蓝蛋白的活[20]性。

近年来，ERS作为一种新的检测工具，充分考虑了多种金属暴露的单独作用及潜在的交互作用。本研究利用该方法对铁和铜共暴露进行了量化，结果显示CVD的发生风险随ERS的增加而增加。

本研究具有一定的局限性。首先，本研究是病例对照研究，不能对铁和铜与CVD之间的关联进行因果推断。其次，本研究的参与者均为40岁以上的男性，结论不能外推至女性或年轻男性人群。因此，未来仍需要更多的前瞻性研究探索铁和铜与CVD之间的关系。