人胚胎肾细胞系HEK293中的翻译调控

柳 满，任 悦，高玉风，王 芳，余 佳

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室, 北京 100005)

人胚胎肾细胞系 293 (human embryonic kidney cell line，HEK293) 是一种最初来源于组织培养的人胚胎肾细胞的特殊细胞系。HEK293细胞是1973年在荷兰莱顿的 Alex van der Eb 实验室通过将健康人胚胎肾细胞中转化入人5型腺病毒DNA 片段培养转化而产生的。这种转化导致病毒基因组中大约4 500个碱基整合到人类HEK细胞的19号染色体中。这些细胞是来自于健康流产的胎儿，其母亲的身份和流产的原因尚不清楚。HEK293之所以这样命名，是因为它是 Graham 的第293次实验[1-2]。从细胞结构看 HEK293细胞具有复杂的核型，每条染色体有2个或更多的拷贝，被称为亚三倍体，染色体数目为64[3]。HEK293细胞具有转染效率高、易于大规模培养、表达蛋白结构接近其在体内的构象等特点。目前，HEK293细胞被广泛应用于蛋白质互作研究、药物筛选以及重组腺病毒包装等方面[4-6]。

翻译是蛋白质生物合成中的关键步骤，而翻译调控对于翻译过程来说具有重要意义。翻译的调控是十分精密复杂的，相比于转录调控，翻译调控更迅速、更高效，且可以通过对翻译的调控进一步控制不同蛋白的空间特异性以及弥补错误转录造成的危害[7]。目前，HEK293细胞在生物学领域应用较广，是大家公认的一种工具细胞系。而对于HEK293细胞基本翻译状态、翻译调控的研究及相关报道却比较少。本文主要对HEK293细胞中翻译调控进行研究探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：人胚胎肾细胞系HEK293(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)。

1.1.2 主要试剂：DMEM 高糖培养基(Solarbio 公司)；胎牛血清FBS和PBS(Gibco公司)；RNase Inhibitor 和 RQ1 RNase-Free DNase(Promega 公司)；抗RPL10A抗体、抗RPL36抗体、抗RPL22抗体和抗 RPS17 抗体均(Abcam 公司)；DynabeadsTMProtein A(Thermo Fisher Scientific 公司)；山羊抗兔、山羊抗小鼠二抗(Beyotime 公司)；建库及测序(Novogene 公司)。

1.2 方法

1.2.1 HEK293细胞的培养：将HEK293细胞培养于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，铺板至汇合度为30%左右，置于含5% CO2的37 ℃的细胞箱中培养。每隔 2～3 d进行传代培养，传代时先用胰蛋白酶将其消化至晃动培养皿大部分细胞脱落后，立即用含有血清的培养基进行终止消化，随后进行离心，细胞计数，铺板传代培养。

1.2.2 Polysome profiling实验检测翻译活跃程度：用cycloheximide(100 μg/mL)处理HEK293细胞，培养箱孵育15～30 min后收集细胞，DPBS洗2遍后液氮速冻，-80 ℃冰箱保存待用。MCB裂解液冰上裂解细胞30 min，在裂解过程中吹打2～3次，5 000 r/min，离心5 min。取上清液后再次进行15 000 r/min，离心10 min。取上清液进行上样超速离心。SW41Ti 水平转头，38 000 r/min, 离心 2 h 45 min。超速离心结束后进行蔗糖梯度分离，分离后收取核糖体各个组分并向组分中加入95%乙醇，同时加入少量糖原助沉，vortex 充分混匀，-20 ℃孵育过夜。

1.2.3 RPL10A 和 RPS17 的 RIP-seq 实验检测参与翻译过程中的mRNA：配置细胞裂解液，并用清洗液对磁珠进行预清除，每10 cm培养皿细胞加入800 μL裂解液，冰上裂解30 min，每10 min用移液枪吹打1次。12 000 r/min，离心15 min，吸取上清液，留出蛋白与RNA的Input，将细胞裂解后上清液分别与RPL10A和RPS17抗体以及beads 进行4 ℃ rotator 孵育过夜。次日用清洗液进行清洗，取出部分作为Input，IgG，IP用作Western blot实验蛋白样品，随后 Western blot 实验进行蛋白质量控制验证。其余部分提取 RNA，作为建库测序样品，并进行 RIP-Seq 建库测序分析。

1.2.4 RIP-Seq(RNA immunoprecipitation coupled with sequencing)建库测序及生物信息学分析：采用新英格兰 BioLabs(Illumina)的NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒进行cDNA文库构建，并在Illumina HiSeq X Ten平台上机进行双端150测序。每组文库重复测序2次。对原始测序数据去除接头后，得到可用的 clean 数据，使用 fastqc 对其进行质量评估。使用 Tophat2(版本2.1.1)将clean 数据比对到人类 rRNA 序列上评估建库质量，参数设置为-min-intron-length 20-max-multihits 1-library-type fr-unstranded。同时，使用同样参数设置将 clean 数据比对到人类基因组(Ensembl hg38.83)。去除多重比对后，使用 htseq(版本0.12.4)计算表达量，DEseq2(版本1.18.1)计算差异基因。以 log2(fold-change)>2，P<0.05 为标准分别筛选IP 及 gG 特异基因，同样以log2(IP/IgG fold-change)>2，P<0.05进一步丰富IP组特异基因，将两部分IP组特异基因定义为RIP靶基因。

2 结果

2.1 HEK293 细胞翻译状态较为活跃

Polysome profiling 结果显示(图1)，HEK293 细胞核糖体组分40S、60S、80S、Polysome 峰分布明显且吸光度(absorbance，Abs) 数值较高，核糖体各组分浓度较高。Polysome 峰数目多， HEK293 细胞处于较高的翻译活性状态。与此同时，用核糖体大亚基蛋白 10A(ribosomal protein L10a，RPL10A)、核糖体大亚基蛋白22(ribosomal protein L22，RPL22)、核糖体大亚基蛋白36(ribosomal protein L36，RPL36) 和核糖体小亚基蛋白 17(ribosomal protein S17，RPS17) 对Polysome profiling实验进行质量控制验证，发现RPL10A、RPL22和RPL36主要分布于核糖体组分60S、80S和多聚峰，RPS17主要分布于核糖体组分40S、80S和多聚峰。根据其核糖体蛋白准确分布情况，可以证明其实验的准确性。

Polysome profiling was used to detect translational activity of HEK293 cells, Western blot was used to verify the distribution of ribosomal proteins图1 HEK293 细胞的翻译活性的检测Fig 1 Detection of translational activity of HEK293 cells

2.2 RPL10A 的 RIP 实验结果

RPL10A抗体可以特异性富集细胞内源性RPL10A蛋白(图2A)。接下来对富集到的RNA进行建库测序分析(图2B)。根据测序结果显示，RPL10A共富集577 个特异性基因，其 IP特有占90.9%，IP和IgG共有占1.6%。同时对富集到的特异性基因进行了基因类型注释(图2C)。基因类型主要为蛋白质编码基因占比83.2%、转录未加工假基因占比4.3%、反义 RNA 占比4.2%、长链非编码 RNA 占比3.8%。

A.protein expression of RPL10A detected by Western blot；B.Venn diagram of immunoprecipitated RNAs with RPL10A and IgG；C.gene types of specific immunoprecipitated RNAs with RPL10A图2 RPL10A 的 RIP-seq 实验结果分析Fig 2 Analysis of RIP-seq for RPL10A

2.3 RPS17 的 RIP 实验结果

RPS17 抗体可以特异性富集细胞内源性RPS17蛋白(图3A)。接下来对富集到的RNA进行RIP-Seq建库测序分析(图3B)。根据测序结果显示，RPL10A抗体共富集740 个基因，其中 IP 特有占 52.8%，IP和IgG共有占24.1%。同时对富集到的特异性基因进行了基因类型注释(图3C)。基因类型主要为蛋白质编码基因占比90.8%、长链非编码RNA占比3.0%、反义 RNA 占比1.9%、转录未加工假基因占比1.5%。

A.potein expression of RPS17 determined by Western blot；B.Venn diagram of immunoprecipitated RNAs with RPS17 and IgG；C.gene types of specific immunoprecipitated RNAs with RPS17图3 RPS17的RIP实验结果分析Fig 3 Analysis of RIP for RPS17

2.4 RPL10A和RPS17 RIP-seq实验结果比较分析

在 RPL10A和RPS17的RIP-seq 实验富集到的基因比较分析中发现共有 129 个基因(图4A)，其中93.8% 为蛋白编码基因(图4B)。与此同时，对这 129 个基因进行了功能富集分析(图4C)，发现涉及到 RNA 剪接、分解代谢过程的负调控、应激激活的丝裂原活化蛋白激酶级联的正调控、对含砷物质的反应、细胞对未折叠蛋白的反应、蛋白质染色体定位、RNA 转运等。其中 RNA 剪接最为显著，其包含的基因有氯核苷酸敏感通道 1A基因(chloride nucleotide-sensitive channel 1A，CLNS1A)、白细胞介素细胞因子基因(cytokine，IK)、核仁蛋白基因(nucleolin，NCL)、桥粒相关蛋白基因(pinin，PNN)、CCCH 型锌指 2基因(zinc finger CCCH-type，ZRSR2)、mRNA 前体加工因子 3基因(pre-mRNA processing factor 3，PRPF3)、甲状腺激素受体相关蛋白 3基因(thyroid hormone receptor associated protein 3，THRAP3)、RNA结合基序蛋白6基因(RNA binding motif protein 6，RBM6)、 丝氨酸/精氨酸相关核基质蛋白 1基因(serine and arginine repetitive matrix 1，SRRM1)、人体免疫缺陷病毒1 型反式激活蛋白特异性因子1基因(HIV-1 Tat specific factor 1，HTATSF1)、G蛋白修补结构域蛋白 1基因(G-patch domain containing 1，GPATCH1)、核旁斑点结构蛋白1基因(paraspeckle component 1，PSPC1)、细胞分裂周期与凋亡调控因子1基因(cell division cycle and apoptosis regulator 1，CCAR1)等(表1)。

A.Venn diagram of specific immunoprecipitated RNAs with RPL10A and RPS17；B.gene types of shared immunoprecipitated RNAs with RPL10A and RPS17；C.gene ontology enrichment of 129 shared RNAs图4 RPL10A和RPS17的RIP实验结果分析Fig 4 Analysis of RIP between RPL10A and RPS17

表1 功能富集分析中的 RNA 剪接相关条目Table 1 RNA splicing in gene ontology enrichment analysis

3 讨论

本文通过对 HEK293 细胞进行翻译调控的研究中发现，通过测序分析获得的 RPL10A 和 RPS17 数据结果交集部分不大，主要考虑以下几点原因：第一，抗体的特异性。每一种抗体都存在特异性的问题，不同的抗体特异性的差异会很大，难以避免在实验过程中获得的分子类型以及数目的差异。第二,不同的核糖体蛋白在翻译的过程中所处的空间位置的差异[8]。RPL10A位于核糖体的大亚基，而RPS17位于的小亚基，不同的空间位阻决定了不同的IP效率。综合以上两点原因分析，可以进一步理解为什么本文在两种不同核糖体蛋白的情况下仅有129个共同基因，但通过对这129个共同基因的进一步分析中发现，这些基因中有93.8%为蛋白编码基因，说明实验的准确性。对共同富集的 129 个基因进行了基因功能富集分析，结果表明RNA剪接最为显著，说明RNA剪接基因在HEK293细胞的翻译过程中较为活跃。

总之，本研究发现在HEK293细胞中活跃翻译基因的主要功能为RNA剪接。