缺氧应激下血管内皮细胞调控小胶质细胞表型及其机制

吴卫江，陆华，徐杰，朱爱华，房文峰，马思原，陈东栋，惠国桢

在氧化应激条件下血-脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的结构和功能将遭到破坏。有研究显示血-脑屏障的开放过程是双时相的，即在首次开放后存在数小时乃至数天的间隔期后出现第二次开放；其机制不明[1]。在血-脑屏障这一血管神经单元中，唯一具有免疫及吞噬活性的是小胶质细胞(microglia,MI)，推测其在开放初期将呈现抗炎修复表型，扮演清道夫的角色，阻滞了微血管内膜损伤后的炎性因子分泌。以往的研究证明，MI有着多种活化类型，而且相互之间可以通过信号分子的传递进行切换[2]。在缺氧应激条件下，MI主要呈现M1样(促炎型)，其产生的氧自由基、氧化亚簇以及金属蛋白酶等加重血-脑屏障的损害[3-4]。然而MI的活性将通过其表面表达的一些负性分子接受神经元、内皮细胞等的调控；其中比较经典的信号分子是CD200及其受体CD200R，在血-脑屏障遭到破坏的同时，活化后的内皮细胞有可能启动负反馈机制，通过自身表达CD200，结合趋化因子的释放来调控MI活性和迁移，使其向M2样(抗炎型)表型转换[5]。文献报道在脑组织损伤模型中损伤部位的MI为M1样和M2样表型的混合，其中M2样表型的反应是短暂的，具有抑制免疫炎症反应和促进组织修复的作用[6]；部分M2样细胞表现出吞噬活性，同时表达吞噬细胞标志物MFG-E8蛋白，不表达炎性因子[7]。随着时间延长，M2表型向M1样表型转变，M1样表型起主导作用[6]。

本研究使用鼠小胶质细胞系(BV2)和鼠血管瘤内皮细胞(EOMA)细胞株进行体外实验，将缺氧培养内皮细胞同MI共育，观察后者CD200R、趋化因子受体CX3CR1、吞噬标记MFG-E8的表达，检测其趋化及吞噬活性；有可能模拟血-脑屏障遭受破坏的前提下，作为免疫监控细胞的MI短时间内聚集缺氧活化后的内皮细胞周围，发挥吞噬及抑炎功能，起到修复和防护血-脑屏障的作用，从而部分解释血-脑屏障受损后出现的双时相现象。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 实验细胞与试剂：EOMA(美国ATCC，CRL-2586)；BV2(美国ATCC，HTX1876)；鼠炎性因子ELISA试剂盒(美国Abbkine，KET7005)；鼠CD200R单抗试剂盒(美国eBioscience，85-14-9201-80)；全蛋白定量试剂盒(美国R&D，PCDH1 IL-2R)；鼠CX3CR1ELISA试剂盒(美国R&D，WTA3603)；鼠CX3CL1抗体试剂盒(美国R&D，EY-(K)-1079)；鼠MFG-E8 IgG单抗(美国Santa Cruz，sc-271574)；鼠β-actin单抗(美国Sigma，AB1001)；Oregon Green的荧光微球(美国GIBCO，17154-10)。

实验仪器：Series Ⅱ 3110 CO2培养箱 (Thermo，美国 )；HX-80 三气细胞培养箱(上海海向仪器设备厂，中国)；Transwell细胞培养小室(Corning Costar，美国)；流式细胞仪(BD LSRFortessa，美国)；倒置相差显微镜(Olympus BX53，日本)；生物荧光显微镜(Olympus BX2，日本)；ibidiCO2孵育系统(ibidi，德国)；7500RT-PCR 仪 (赛默飞，中国 )；DK-8AXX 电热恒温水槽 (上海一恒科技，中国 )。

1.2 方法

1.2.1 内皮细胞缺氧损伤模型建立及表型鉴定 取体外培养至三代的EOMA培养板放入三气培养箱(1% O2，5% CO2，94% N2，37 ℃)中培养，对照组细胞置于正常培养箱(5% CO2，95%空气，37 ℃)中培养。6 h后分别移出各自的培养箱，观察两组细胞的形态变化，测定细胞存活率；用ELISA法检测各组细胞的CD62E、CD200表达水平，同时取各自细胞上清液检测炎性因子白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素6(interleukin-6，IL-6)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)水平，检测方法按试剂盒说明进行操作，每组实验重复3次。

1.2.2 细胞分组及实验过程 (1)BV2以普通培养基孵育的对照组；(2)正常EOMA培养上清孵育组；(3)缺氧EOMA培养上清孵育组；(4)与正常EOMA细胞共育组；(5)与缺氧EOMA共育组。以培养板和8 μm孔径的transwell构建细胞的共育体系，下层培养BV2细胞，上层接种EOMA细胞。共育结束后移走transwell小室，对孔板培养皿中的BV2细胞进行检测。分组实验过程：将三气培养箱中培养6 h后的EOMA细胞移出后置入正常培养箱中继续培养6 h，正常培养的EOMA细胞则孵育12 h，作为分组实验的时间点。分别收集细胞及上清液，将正常或缺氧组上清与新鲜培养液按1∶3的比例来培养BV2细胞；将每孔收集的正常或是缺氧EOMA细胞分成3等份分别与BV2细胞共育。24 h后观察各组细胞形态，进行MTT细胞存活率测定，继而应用ELISA法检测各组细胞CD200R、CX3CR1的表达水平。同时采用免疫印迹法测定各组细胞的MFG-E8蛋白表达水平。用流式细胞术(flow cytometry,FCM)测定各组细胞吞噬活性。每样检测均重复3次。

1.2.3 CD200R表达检测 采用免疫荧光法。各组细胞培养24 h后，重复3孔，每组至少重复3次，共育组移去transwell小室，去上清，漂洗后固定，加CD200R一抗4 ℃孵育过夜，荧光二抗处理后缓冲液再次漂洗，显微镜下观察。

1.2.4 CX3CR1表达检测 采用ELISA法。上述5组细胞培养24 h后去上清，漂洗后加入细胞裂解液，匀浆器匀浆，离心后取上清。依照全蛋白定量试剂盒操作说明配置蛋白标准液，绘制蛋白定量标准曲线。取5组待测样品适量，加入考马斯亮蓝G250染液后混匀，测定595 nm处的OD值，然后在标准曲线上求总蛋白浓度。按鼠CX3CR1-ELISA试剂盒操作步骤，检测待测蛋白样品，结合总蛋白浓度，计算5组样本的CX3CR1含量。

1.2.5 MI趋化实验 应用有自动拍照对焦功能的相差显微镜，配备镜载加热孵育系统(37 ℃，5% CO2)，应用ibidi 细胞趋化载玻片进行实验。将体外培养第三代的BV2细胞调节浓度为1.0×106/mL，将细胞接种在中间通道，载玻片放入培养箱中30～35 min，细胞贴壁后分别在两边储液池中加入60 μL普通培养基作为对照组；第2组在一边加入60 μL正常EOMA培养上清，同样数量的普通培养基加入另一边储液池；第3组两边分别加入60 μL缺氧EOMA培养上清和普通培养基；第4组在第3组加入缺氧EOMA培养上清的池内追加CX3CL1抗体，将通道加液孔塞紧后可以进行图像采集，将载玻片置入镜载加热孵育系统中，调整好采集位点，进行18 h的观测，每20 min采集一张图片。应用ImageJ软件中Manual Tracking功能进行图像数据处理，得到细胞轨迹的坐标表格数据。

1.2.6 MFG-E8蛋白表达水平检测 用Western Blot法提取各组细胞总蛋白。配制分离胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，分离蛋白区带电泳转移到NC膜上，封闭液处理后将膜置于含MFG-E8 IgG(1∶250)单抗、β-actin单抗(1∶2 000)的胎牛血清封闭液中，孵育过夜，洗膜。再将NC膜置于HRP标记二抗中孵育，洗膜后将ECL化学发光试剂A液和B液等体积混合，NC膜正面朝上，显色液覆盖结合二抗的NC膜，室温孵育后用化学发光仪检测条带的灰度值，计算目的蛋白与β-actin的灰度值比值，用ImageJ软件中的Gel分析工具对各组蛋白进行定量测定比对。

1.2.7 MI吞噬功能检测 各组细胞培养24 h后去上清，洗涤后加入新鲜DMEM培养基，同时在相应的板孔中按一定的比例(细胞∶微球=1∶50～100)加入直径为0.2 μm的掺有Oregon Green的荧光微球，吞噬30 min后进行FCM检测和分析(FL1通道)。

2 结 果

2.1 缺氧组与正常组细胞表面标记物及炎性因子表达水平比较 与正常组相比，缺氧组细胞的CD62E、CD200及IL-1β、TNF-α、IL-6表达水平均显著升高，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表1、2。

表1 缺氧组与正常组细胞CD62E、CD200的表达水平比较

表2 缺氧组与正常组细胞IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平比较

2.2 各组细胞的成活率比较 MTT法检测结果显示，正常EOMA培养上清孵育组及缺氧EOMA培养上清孵育组细胞的OD值(细胞存活率)均比对照组显著降低(均P<0.05)；正常EOMA细胞共育组及缺氧EOMA细胞共育组的OD值稍升高，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 各组细胞CD200R免疫荧光染色结果 普通倒置显微镜下显示，A、D、E组细胞均符合静息状态下MI形态特征；B、C组细胞多呈现不规则形态，突起变短或消失，细胞分布明显较其他3组稀疏，细胞间彼此不连接；荧光染色后细胞均呈CD200R阳性(图1)。

A、D、E：细胞均为长梭形； B、C：细胞呈不规则形态，突起变短或消失，分布稀疏；5组细胞均为CD200R阳性(×200，图中标尺为100 μm)

2.4 各组细胞CX3CR1蛋白表达水平比较 缺氧内皮细胞培养上清孵育组及共育组细胞的CX3CR1蛋白表达水平明显高于对照组，同时共育组的表达水平又高于孵育组，差异均有统计学意义(均P<0.01)。正常内皮细胞上清孵育组及共育组与对照组细胞的CX3CR1蛋白表达水平的差异均无统计学意义(均P>0.05)(图2)。

2.5 MI趋化实验结果 正常对照组细胞运动呈现出无序性，正常内皮细胞培养上清并没表现出对MI的趋向性，而缺氧内皮细胞培养上清则表现出了明显的趋化特征，当在缺氧内皮细胞培养上清中加入趋化因子抗体后则中和了这种趋向特征，细胞运动恢复了无序状态(图3)。

2.6 各组细胞MFG-E8蛋白表达水平比较 两组共育组细胞的MFG-E8蛋白表达水平提高，特别是缺氧共育组表达量最高，与对照组相比差异均有统计学意义(均P<0.05)。正常上清孵育组与对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；而缺氧上清孵育组的表达水平最低，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)(图4、5)。

与A、B、D组相比*P<0.01；与C组相比#P<0.01

缺氧后的内皮细胞培养上清里含有趋化因子，对MI产生了趋化特性，这种趋向性能够被趋化因子CX3CL1抗体所拮抗；正常内皮细胞及对照组细胞培养上清内均不存在特定的趋化因子，细胞运动呈现无序状态

图4 各组细胞MFG-E8蛋白免疫印迹检测结果

图5 各组细胞的MFG-E8蛋白表达水平

2.7 各组细胞吞噬功能比较 正常对照组MI在吞噬活性上表现出异质性，仅有部分细胞表现为低度的吞噬功能；在用正常内皮细胞培养上清时MI活性开始提高，但主要表现为低吞噬活性，与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；而在同正常内皮细胞共育后这种特性并没有发生明显改变(P>0.05)。缺氧内皮细胞上清孵育组的MI吞噬活性明显下降(P<0.05)；而缺氧内皮细胞共育组的MI吞噬活性明显升高(P<0.01)(图6、7)。

3 讨 论

在脑组织缺氧应激条件下微血管内皮细胞是首先感受并活化的细胞，其活化后会表达并释放多种炎性介质，加剧血-脑屏障的开放[8]；紧接着作为CNS免疫监控细胞的MI在缺氧和各种炎性刺激因子作用下迅速被激活，并在整个神经炎性损伤过程中起着至关重要的作用。受周围微环境的调控其作用存在明显两面性的特征，既有吞噬和抗炎活性，也可炎性活化产生大量炎症和趋化因子，进一步加剧血-脑屏障的损伤形成恶性循环。活化后的内皮细胞在表达一系列炎性表型的同时，也会表达一些负反馈的免疫抑制信号来“关闭”和控制自身及邻近免疫细胞的炎性通路；如CD200的表达能有效地抑制活化内皮细胞的NF-kB通路，同时与MI的CD200R通过细胞间的直接接触从而控制后者的过度炎性活化[9]。这样的免疫调控机制在血-脑屏障开放后抑制了内皮细胞和MI的炎性因子分泌，从而维持CNS环境相对稳定，避免了炎症反应及损伤的扩大化。

A组：大部分MI无吞噬活性，部分为低吞噬活性，只有极少数为高吞噬活性； B组：吞噬活性的总比及高吞噬活性占比均有上升； C组：表现吞噬活性的比例明显减少； D组：吞噬活性的总比及各构成比与对照组无明显差异； E组：吞噬活性明显升高，并且多为高吞噬活性。注：M0为非吞噬活性的MI百分比，M1区域为低吞噬活性MI百分比，M2为高吞噬活性MI百分比

图7 各组细胞MI吞噬火星FCM结果比较

本实验结果发现，以缺氧EOMA培养上清孵育的BV2细胞形态上表现为胞体变大、突起回缩、呈阿米巴样，并且CD200R表达减少，提示处于炎性激活状态；结合缺氧EOMA培养液的活化检测结果表明，缺氧EOMA表达的一系列炎症因子及趋化因子、粘附分子等导致了BV2细胞向M1型活化，作为炎性毒性表型表达更多炎性介质并同活化EOMA表达的炎性因子产生叠加效应。

BV2与缺氧EOMA共育组则产生了绝然不同的效果，BV2细胞形态上仍然保持静息状态下的梭型外观，胞体较大、突起细长、相互交织成网、CD200R染色呈强阳性，结合缺氧应激下的EOMA细胞CD200表达水平的增加，该共育组很可能为活化后的EOMA通过CD200-CD200R信号通路抑制了MI的炎性激活，使其由促炎型M1型向抗炎型M2型转化。

但是正常EOMA培养上清孵育组MI不仅出现了炎性活化表现，同时细胞存活率也出现了下降；推测正常培养状态下的内皮细胞仍会不间断产生抑制MI增殖同时促进细胞活化的因子，而在生理状态下由于基底膜的阻隔这些由内皮细胞产生的因子并没有对MI产生影响；其机制有待进一步深入研究。

实验结果同样可推断受缺氧EOMA表达的趋化因子影响，其培养液孵育的MI高表达趋化因子受体，而BV2与缺氧EOMA共育组该受体的表达量升高更为明显，提示内皮细胞损伤后即刻动员MI向血-脑屏障破坏区聚集，趋化实验也证实了这一点。短时间大量的MI堆积将构建一道血-脑屏障外围新的屏障，使血-脑屏障暂时得到了修复。

两组共育组特别是BV2与缺氧EOMA共育组细胞的MFG-E8蛋白表达水平明显提高，表明MI吞噬活力增强。有研究报道MI在一些具有趋化因子作用的分子诱导下能向损伤位置迁移，而MI聚集到神经损伤位置后，将发挥其吞噬功能[10-11]。根据本研究的结果推测，活化的MI突破损伤的血-脑屏障基底膜后有可能与受损的血管内皮细胞直接接触，受活化内皮细胞的分子调控，由M1型细胞向M2型细胞转化，并发挥其吞噬活性，同时减少炎性因子的分泌，客观上起到了修复血-脑屏障的作用。而MI在缺氧EOMA培养上清孵育组的MFG-E8蛋白表达水平则明显下调，表明炎性毒性表型下的MI吞噬活性下降(MI吞噬活性实验也证实)；各组细胞荧光微球吞噬实验显示，MI同缺氧内皮细胞共育后，前者表现出高度的吞噬活力。

既往的研究已经证明了MI的活性受神经元调控。本研究结果证实其与缺氧内皮细胞间同样通过直接接触和分子传递，在自身存活、活化等一系列生物学功能中发挥重要的作用。缺氧内皮细胞上清中包含炎性因子可能通过Toll样受体促使MI向炎性毒性表型转化[12-13]；而其自身由于早期高表达负性调控分子CD200，并在趋化因子作用下同MI直接接触，通过上调后者表面的CD200R使之形成M2a样状态；该极化状态将激活其清道夫受体并增强吞噬活性，表现为血-脑屏障功能的短暂修复，炎性因子分泌减少。然而，无论缺氧内皮细胞抑或神经元，随着缺氧时间的延长，最终CD200表达水平会迅速下降[13]，导致无法控制MI炎性毒性的活化，进一步加剧血-脑屏障的破坏；或许这能部分解释在脑损伤动物模型上观察到的血-脑屏障开放双时相现象。