鸡肝破裂血水综合征病因初探

（青岛易邦生物工程有限公司，动物基因工程疫苗国家重点实验室，山东青岛 266032）

近年来，我国养鸡业出现了一种以鸡肝脏肿大出血、质地变脆、腹腔血水为主要特征的疾病，暂命名为鸡肝破裂血水综合征。临床发病所涉品种宽泛，白羽肉种鸡、商品蛋鸡、蛋种鸡等均有发病，但黄羽系列未见发病。在所有种鸡发病案例中，均为母系，父系正常；同一鸡场不同品种，在饲养条件相同情况下，有的品种发病，有的正常；发病阶段集中在育成中后期（7～20周）、产蛋上升期（20～35周），个别高峰期后也偶有发病；发病无地域差别，也无明显季节性，全年均可发病，其中在秋冬或春秋季节因应激反应，发病率相对较高；高强度免疫（特别是菌苗免疫）、产前加光等应激因素等可加重或促进发病，对养殖生产造成较大损失。

该病在临床上不同于以往引起鸡肝脏病变的疾病，如禽戊型肝炎（HE）、脂肪肝综合征（FLS）、禽白血病（AL）、禽腺病毒病和霉菌毒素中毒等[1-5]。近期，国内学者关于该病的发病原因也做了大量工作，对可引发鸡肝脏问题的传染性疫病进行了初步筛查，认为该病主要由禽戊型肝炎病毒或禽白血病病毒引起[6-8]，但样本数量和调查范围仅局限于个别地区的单一品种，而缺乏系统全面的检测分析。本研究通过对11 省区市的9 种品系鸡共计458 份临床肝破裂样本进行检测分析，发现鸡肝破裂血水综合征与鸡体本身存在遗传性自身免疫性缺陷因素有关，其他如病原、应激等因素可进一步加重病情，但非该病的直接原因。本研究为该病的有效防控和进一步深入研究指明了方向。

1 材料

1.1 病料来源

采自山东、河北、云南、四川等11 省区市的病料，涵盖了国内外的主要鸡品种，共计458 份，详见表1 和图1。

1.2 试剂与耗材

PCR 试 剂 和Marker，为Takara 公 司 产 品；RT-PCR 试剂，为湖南艾克瑞公司产品；50×TAE buffer，为上海生工生物工程有限公司产品；Goldview 核酸染料，为labest 公司产品；琼脂糖，为康为世纪生物科技有限公司产品；核酸提取纯化试剂，为杭州博日科技有限公司产品；禽白血病病毒（ALV）P27 蛋白ELISA 检测试剂盒，为爱德士公司产品；胰蛋白胨大豆琼脂，为青岛海博生物公司产品；沙显培养基，为郑州人福博赛生物技术有限责任公司产品；弯曲杆菌培养基，为青岛中创汇科公司产品。

表1 采集样本基本信息 单位：份

图1 临床发病鸡肝破裂图片

1.3 仪器与设备

超净工作台（北京东联哈尔仪器公司），离心机（eppendorf 公司），核酸提取纯化仪（杭州博日科技有限公司），电泳仪（北京六一生物科技有限公司），凝胶成像仪（上海培清科技有限公司），移液器（eppendorf 公司），以及生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）。

2 方法

2.1 病原分离

2.1.1 细菌分离 无菌采集肝脏样本，分别接种于胰蛋白胨大豆琼脂培养基、沙门氏菌显色培养基和弯曲杆菌专用培养基；培养后对单菌落纯化，分别使用鉴别培养基、染色镜检、16S rRNA 引物等进行鉴定。分子检测中对16S rRNA 呈阳性的样品进行测序分析，测序结果用Blast 在线分析软件在Nucleotide 数据库中进行序列同源性比对，根据序列同源性鉴定细菌种属。

2.1.2 病毒分离 方法一：将2.1.1 中检测结果为阴性的组织样本（选择有代表性样本共计33 份）预处理后离心（12 000 r/min，10 min）取上清；经0.22 µm 滤器过滤后，通过卵黄囊和绒毛尿囊膜途径分别接种6 日龄和9 日龄SPF 鸡胚，每枚鸡胚接种0.2 mL，连传3 代，观察胚体变化；收获胚体肝脏、尿囊膜和尿囊液，采用PCR 和RT-PCR方法检测马立克病毒（MDV）、禽戊型肝炎病毒（HEV）、禽腺病毒（FAdV）和鸡传染性贫血病毒（CIAV）。方法二：将2.1.2 中的病料滤液同时接种DF-1 细胞与LMH 细胞，5～9 d 传代1 次，连传3 代，注意观察细胞有无病变；收获细胞液，DF-1 细胞培养液应用ELISA P27 抗原检测试剂盒检测ALV，LMH 细胞培养液采用PCR 和RT-PCR方法检测MDV、HEV、FAdV 和CIAV。

2.2 分子生物学检测

2.2.1 PCR、RT-PCR 采集临床疑似肝破裂出血综合征鸡群肝脏样本，剪碎、研磨、冻融、离心处理，采用全自动核酸提取试剂盒提取组织DNA和RNA；分别设计MDV、ALV、HEV、FAdV、CIAV 引物进行PCR 和RT-PCR 检测，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列、扩增片段长度以及目的基因见表2。PCR 反应条件：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸90 s，共32 个循环；72 ℃延伸5 min。RT-PCR 反应条件：50 ℃反转录30 min，95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火35 s，72 ℃延伸90 s，共32 个循环；72 ℃延伸5 min。

表2 引物序列、目的片段长度以及目的基因

2.2.2 Random PCR 对2.2.1 检测结果为阴性的样本，采用Random PCR 方法[9]进行未知病原筛查。

2.3 病理学诊断

采集新鲜病料样本以10%福尔马林固定，将固定好的标本冲洗、脱水后进行浸蜡、包埋，然后修整组织边缘，进行切片；将切好的组织切片在40～45 ℃水浴锅水面上铺片，之后贴片，然后将载玻片置于恒温箱烘干，用苏木素-伊红染色法染色，然后封片，置于显微镜下观察。

2.4 内毒素检测（动态浊度法）

2.4.1 溶液制备 A 为稀释倍数不超过MVD 的供试品溶液，B 为加入λm 内毒素且与A 溶液有相同稀释倍数的供试品溶液，C 为用于制备标准曲线的内毒素标准溶液，D 为阴性对照（检查用水），详见表3。

表3 各反应样品制备

2.4.2 加样及反应 预热动态试管检测仪30 min以上，将相应溶液A、B、C、D 加至反应管中；打开动态试管检测仪系统软件，进入数据采集模块，根据要求设置相关参数，点击开始；复溶鲎试剂，沿壁分装至反应试管，0.1 mL/管；将每支反应管内混合液混匀后，插入动态试管检测仪中进行反应。

2.4.3 结果判读 若供试品溶液A 所有平行管内毒素浓度平均值乘以稀释浓度后，小于规定的内毒素限值，则判供试品符合规定，否则判供试品不符合规定。

2.5 动物试验

选取20 只6 周龄SPF 鸡，其中试验组与对照组各10 只。试验组腹腔注射上清液（已冻融、离心、过滤除菌）2 mL/只，对照组腹腔注射生理盐水2 mL/只，观察12 d，记录精神、采食、死亡情况等。

2.6 流行病学调查

对临床表现为肝破裂出血的样本进行流行病学调查，包括品种、日龄、发病季节以及发病规律，对搜集的临床信息进行汇总分析。

3 结果与分析

3.1 病原分离

3.1.1 细菌分离 11 省区市送检的458 份肝脏样本细菌分离结果（表4）显示，检测到大肠杆菌14份，占2.8%；沙门氏菌7 份，占1.5%；弯曲杆菌0 份。结果表明，发生肝破裂血水综合征样本中的细菌以大肠杆菌为主，零星有沙门氏菌，但分离率均较低，分离检测没有共性，提示肝破裂血水综合征的发生与细菌感染无明显相关性。

3.1.2 病毒分离 选择典型代表性样本33 份，采用鸡胚和细胞进行病毒分离。结果显示，F1—F3 代鸡胚无死亡、胚体无变化，F1—F3 代细胞无明显病变；采用PCR 方法检测FAdV、CIAV、MDV，结果均为阴性；采用RT-PCR 方法检测HEV，结果为阴性；采用ELISA 方法检测ALV P27 蛋白，结果为阴性。结果表明，可排除HEV、FAdV、CIAV、MDV、ALV 为肝破裂血水综合征原发病原的可能性。

表4 细菌分离结果 单位：份

3.2 分子生物学检测

3.2.1 PCR、RT-PCR 对11 省区市458 份样本采用PCR 和RT-PCR 方法检测送检样本。结果（表5）显示，检测到FAdV 3 份，占0.66%；HEV 1 份，占0.22%；CIAV、MDV、ALV 均为0 份。结果表明，虽然极少样品有FAdV、HEV 等核酸阳性检出，但其感染与肝破裂血水综合征临床表征不一致，且检测结果不具有共性，故可排除原发病原的可能性。

3.2.2 Random PCR 分别按照DNA 和RNA病毒两种途径进行Random PCR，结果发现，经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，按照RNA 病毒途径的产物电泳未见清晰条带，按照DNA 病毒途径的产物电泳在200～2 000 bp 之间有明显核酸条带（图2），提示原始病料中不存在核酸类型为RNA 的病毒，可能有核酸类型为DNA 的病毒。将按照DNA 病毒途径扩增出的PCR 产物酶切鉴定，挑选200 个阳性克隆测序，经Blast 分析比对，发现所有插入片段均为鸡的基因，即原始病料中不存在DNA 病毒。检测结果表明疑似发生肝破裂血水综合征的样本中不存在RNA、DNA 病毒。

表5 PCR 和RT-PCR 检测结果 单位：份

图2 样品Random PCR 电泳结果

3.3 病理学诊断

选取99 份经福尔马林固定的组织样本，进行病理切片观察。结果（表6、图3）显示，疑似髓样白血病/白血病病理变化0 份；疑似细菌造成的坏死性肝炎4 份，占比4.04%；疑似网状内皮细胞增生病并发血管瘤病理变化2 份，占比2.02%；其余多数样本均有淀粉样渗出，未发现明显病理变化，占比93.94%。结果表明，送检的肝破裂血水综合征样本多数以淀粉样变为主，零星有细菌感染，与病原检测结果具有高度一致性，可进一步排除病毒感染的可能性。

表6 病理学诊断结果

3.4 内毒素检测

检测结果（表7）显示，15 份样本内毒素超标，占比3.3%。肝脏破裂样本中采集血水、肝脏、个别注射部位肌肉等，通过内毒素含量对比检测发现没有显著共性联系。此外内毒素含量偏高的样本，肝脏检测显示有细菌感染，故内毒素含量偏高，但与造成肝脏破裂出血病因没有直接关联。

3.5 动物试验

SPF 鸡腹腔注射后观察12 d，发现鸡群精神、采食正常，鸡群无死亡。人为致死鸡只后解剖观察发现，攻毒组鸡只内脏无特征表现，个别肝脏出现片状出血斑，颜色暗红，有区域性淤血，对照组鸡只显示肝脏质地良好，颜色均匀一致，两组差异不明显（图4）。采用PCR 和RT-PCR 方法对两组肝脏样本分别进行ALV、FADV、HEV 检测，结果均为阴性，不能复制肝破裂血水的临床表征，进一步说明ALV、FADV、HEV 等病原不是造成肝破裂血水综合征的原发病原。

图3 不同类别肝破裂病理切片

表7 内毒素检测结果

图4 攻毒后肝脏照片

3.6 流行病学调查

3.6.1 发病品种 白羽肉种鸡、商品蛋鸡、蛋种鸡等均有发病，但黄羽系列未见发病。白羽肉种鸡以A、B 品种发病较重，D 品种发病轻，C 品种未发病；蛋鸡系列A、B、C 品种发病较重，E 品种发病轻，D 品种正常。在所有种鸡发病案例中，均为母系发病，父系正常。

3.6.2 高发日龄 发病阶段集中在育成中后期（7～20 周）、产蛋上升期（20～35 周），个别高峰期后也偶有发病。

3.6.3 发病区域及季节 发病无地域差别；该病无明显季节性，全年均可发病，其中在秋冬或春秋季节因应激反应，发病率相对较高。

3.6.4 其他情况 高强度免疫（特别是菌苗免疫）、产前加光等应激因素可加重或促进发病。

4 讨论

国外很早就有关于鸡肝脏问题的报道，Nesheim 等[10-11]在1970 年前后通过对39 例鸡脂肪肝出血综合征（FLHS）病鸡进行遗传分析，发现11 只母鸡是同一公鸡的后代，证明了该病具有很强的遗传相关性。Carlich 等[12]对在相同条件下饲养的鸡群随机取样并进行脂肪肝含量分析发现，脂肪肝含量因鸡的品种、品系不同而有很大差异。以上研究表明，FLHS 具有遗传性。本研究通过流行病学调查分析，发现鸡肝破裂血水综合征发生区域广、损失大，与特定品种和品系存在相关性，同一鸡场饲养不同品种，在条件相同的情况下，有的品种发病，有的不发病。另外与品系也有相关性，同一来源品种出现母系发病，父系正常，祖代也出现肝破裂情况，多表现在D 系慢羽，其他A、B、C正常，D 系快羽也轻，反映到下游父母代具有一致相关性。通过上游了解与种源换羽无相关性，也不存在四系配套混乱情况。

应激因素可以加重鸡的肝脏疾病。相关研究[1，13-15]表明：油苗免疫期尤其是细菌苗的免疫对鸡体刺激非常大，常常引起肝硬化、出血等临床表现；在流行病学调查过程中发现，一些肝破裂出血病例鸡群往往在免疫灭活苗后发生，其严重程度要比未免疫鸡群高，死亡率上升明显。

相关研究[16-19]表明，HEV、空肠弯曲杆菌、ALV、FAdV 等病原可以引起鸡肝脏的一系列病理变化。本研究中部分样品零星检测到HEV、FADV等相关病原，但病原检测不具有一致性，而且通过临床诊断与肝破裂出血没有直接相关性；部分样品检测到大肠杆菌、沙门氏菌等细菌，通过临床判断为应激条件下激发所致，与肝破裂出血没有直接相关性；内毒素检测有少部分超标，且超标样品临床有细菌感染，内毒素与肝破裂出血没有直接相关性；病理诊断显示部分样品有禽网状内皮组织增生症病变，但核酸检测和病毒培养均未有检出。另外在病理切片观察中，93.94%样本均有淀粉样和纤维样渗出，提示鸡体出现炎性反应过度。

临床发生肝破裂血水综合征，首先以肉种鸡特定品种为主，逐渐过渡到蛋鸡品系，流行范围广、持续时间长、所涉品种多，全国不同实验室广泛采样、利用不同检测方法等均无特定病原检出，提示造成此次肝破裂血水综合征的原发病原可能为非传染性因素；疫病流行期间国内种源相对匮乏且疫苗免疫频次繁多，加速了肝破裂血水临床表征出现，造成此疫病为传染性病原的假象。

根据实验室病原检测结果并结合流行病学调查，初步认为是机体本身存在遗传性自身免疫性疾病，造成机体反应过度，出现细胞因子风暴综合征导致鸡肝脏淀粉样出血。该病主要由外源性物质（病原性与物理性病因）致机体发生持续性慢性炎症，从而导致过多酶解形成的错误折叠蛋白链凝集成不溶性纤丝。这种分子构成使淀粉样蛋白极度不溶，并几乎可完全抵抗蛋白酶作用，因而淀粉样蛋白一旦在细胞和组织中沉积就几乎不可能清除，淀粉样浸润最后导致细胞消亡和组织破坏、死亡[20]，最后使得肝细胞产生淀粉样蛋白，肝脏堆积而使肝脏形态与功能受损，肝脏内堆积的淀粉样蛋白纤维原一旦形成很难被消除，从而导致肝脏破裂出血。

目前对该病尚无有效解决方案。最重要的方式是引种时选择优良品种，其次是减少应激。特别要加强疫苗免疫操作的规范性，尤其注意油乳剂疫苗的预温和摇匀；科学设计免疫程序，避免大剂量、多种疫苗同时或免疫间隔过短；最后注意开产前减少多重应激，加光时避免其他应激因素等。