黄花蒿花粉新过敏原烯醇化酶鉴定：重组纯化及IgE结合活性

2021-05-11凌晓静许志强胡巧丽潘晨朱理想魏继福

中华临床免疫和变态反应杂志 2021年2期

凌晓静，许志强，胡巧丽，潘晨，朱理想，魏继福

过敏性疾病发病率在全球范围内逐步升高，其中花粉诱导的过敏性疾病也呈逐步上升趋势[1]。据统计，我国蒿属植物有187种，主要分布于我国北方和西南地区，是引起过敏性鼻炎和气道高反应性疾病的主要室外过敏原[2-4]。蒿属植物花粉颗粒较小，直径为19～25 μm易随风飘散，产粉量大，且患者过敏症状的严重程度与空气中花粉含量呈相关性，蒿属花粉是我国北方夏秋季主要气传性花粉过敏原[1,5-6]。其中，大籽蒿(ArtemisiasieversianaWilld)、黄花蒿(A.annuaL.)和艾蒿(A.vulgaris)是我国蒿属致敏花粉的三大主要来源，不同于欧洲以艾蒿花粉为主[4]。然而，目前用于过敏原特异性IgE检测的“金标准”ImmunoCAP，其检测对象还是主要针对艾蒿(商品编码：w6)、苦艾蒿(商品编码：w5)以及部分已鉴定的艾蒿过敏原分子Art v 1(商品编码：w231)和Art v 3(商品编码：w233)。虽然国内已有黄花蒿花粉变应原点刺液和注射液产品，但其中未明确具体过敏原分子信息,极大地限制了产品标准的制定、患者致敏特征和治疗效果在分子水平上的评估以及诊断产品和疫苗的进一步研究发展。迄今为止，已被国际免疫学联合会(International Union of Immunological Societies, WHO/IUIS)命名的黄花蒿花粉过敏原分子共有4种，分别为A.annua1[7]、A.annua2[7]、A.annua3[7]和A.annua7[7-8](http://www. allergen.org)，相比于其同属物种艾蒿已鉴定的6种过敏原分子(Art v 1-6)[9-14]，对黄花蒿花粉过敏原分子的研究较少，仍可能存在未明确过敏原。本研究结合转录组学对黄花蒿花粉进行分析并寻找其中潜在新过敏原，进一步完善黄花蒿花粉中致敏组分信息及其在中国人群中的致敏特征，以促进精准的分子诊断和治疗发展。

1 方法与材料

1.1 材料

黄花蒿花粉转录组测序由北京奥维森基因科技有限公司负责，南京金斯瑞生物科技有限公司主要负责DNA引物合成以及克隆菌基因测序。PCR试剂盒(TaKaRa Ex Taq, 10×Ex Taq Buffer, dNTP Mixture)，TA克隆试剂盒(pMDTM19-T Vector Cloning Kit)，DNA凝胶纯化试剂盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)，pET-28a质粒载体限制性双切酶(QuickCutTMXho Ⅰ和QuickCutTMNco Ⅰ)，异丙基硫代半乳糖苷 (isopropyl thiogalactoside, IPTG)等都购于宝生物工程(大连)有限公司。重组克隆试剂盒(ClonExpress Ⅱ one step Cloning Kit)购于诺维赞公司。纯化重组蛋白的high affinity Ni-NTA resin购于金斯瑞生物科技有限公司。用于ELISA实验的四甲基联苯胺(tetramethyl benzidine, TMB)显色液、终止液购于碧云天生物技术公司，Anti-IgE(辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)标记的羊抗人的IgE)购于美国KPL公司。 Western blot实验中的ECL显影液和PVDF膜均购于Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 黄花蒿花粉烯醇化酶基因克隆和扩增

将转录组测序结果与WHO/IUIS过敏原数据库中的序列进行BLAST(basic local alignment search tool, BLAST)同源序列比对分析，得到一个与其他物种过敏原同源的黄花蒿花粉烯醇化酶(enolase)潜在过敏原序列。根据所得烯醇化酶cDNA序列设计引物5′-CGGGGGATTCCAGTTTC-3′，5′-GATTGCATGGACACTCAAC-3′，进行PCR扩增，对产物TA克隆并测序进一步验证。根据序列编码区设计重组引物并克隆至pET-28a的NcoⅠ和XhoⅠ位点构建重组质粒。

1.2.2 黄花蒿花粉烯醇化酶序列比对

根据allergome数据库(http://www.allergen. org)中收录的已报道蛋白类型属于烯醇化酶的过敏原序列，利用clustalX2与黄花蒿花粉烯醇化酶进行多重序列比对，分析与其他物种烯醇化酶氨基酸序列之间的保守性。运用MEGA7采用邻近法(N-J法)构建进化树分析其进化关系。

1.2.3 黄花蒿花粉烯醇化酶的表达和纯化

将已经构建好的含有编码黄花蒿花粉烯醇化酶的重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，加入终浓度1 mmol/L IPTG诱导蛋白表达，通过SDS-PAGE电泳验证并挑选能够表达目的蛋白的菌落并进行大规模诱导培养，通过SDS-PAGE验证蛋白在大肠杆菌中的表达形式后，变性条件下(100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)通过Ni2+亲和层析纯化目的蛋白并使用梯度透析法(8→6→4→2→0 mol/L)除去蛋白中的尿素进行蛋白复性。

1.2.4 酶联免疫吸附反应实验(enzyme-linked immunosorbent reaction, ELISA)

将1μg的重组黄花蒿花粉烯醇化酶于4 ℃过夜包被至ELISA板孔中，并用1%牛血清白蛋白(BSA)封闭。后加入1∶10稀释于PBS-0.1% Tween 20的蒿属过敏患者血清100μL/孔，37 ℃孵育2 h后使用PBS-0.1% Tween 20进行洗涤，使用HRP标记的羊抗人IgE作为二抗和TMB显色液对结合在黄花蒿花粉烯醇化酶上的IgE进行检测。

1.2.5 免疫印迹实验(Western blot)

10 μg的黄花蒿烯醇化酶经过SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜，经过5%脱脂牛奶封闭后，与ELISA中阳性的血清(1∶10稀释于PBS-0.1% Tween 20)在4 ℃孵育过夜，洗涤后使用HRP标记的羊抗人IgE和化学发光法检测结合在PVDF膜上黄花蒿花粉烯醇化酶的IgE。

1.2.6 竞争抑制实验(inhibition enzyme-linked immunosorbent reaction, iELISA)

2 结果

2.1 黄花蒿花粉烯醇化酶基因的克隆和扩增

转录组测序所得黄花蒿烯醇化酶基因序列经PCR扩增，琼脂糖电泳结果显示扩增产物大小在1 000～2 000 bp之间(图1A)。随后对产物克隆和测序得到一个长度为1 433 bp的基因片段，开放阅读框为1 335 bp，编码444个氨基酸(图1B)。根据clustalX2的多重序列比对，黄花蒿花粉烯醇化酶与矮豚草Amb a 12的相似性最高(91%)，其次为橡胶树Hev b 9(89%)，与玉米Zea m 22和百慕大草Cyn d 22相似性均为88%，与其他14个烯醇化酶过敏原的氨基酸序列的相似性在56%～68%之间(图2)。对黄花蒿花粉烯醇化酶与18个其他来源的烯醇化酶过敏原进行进化树分析，黄花蒿花粉烯醇化酶与矮豚草Amb a 12聚为一簇，同属于菊科植物，自展值为72。黄花蒿花粉烯醇化酶连同Amb a 12又与大戟科橡胶树乳胶Hev b 9聚成一簇，自展值为63(图1C)。

2.2 黄花蒿花粉烯醇化酶的表达、纯化

根据诱导超声后SDS-PAGE电泳图验证蛋白主要以包涵体表达(箭头处所示)，重组蛋白C末端含有加入的六个组氨酸标签，在变性条件下经镍离子Ni2+亲和凝胶层析纯化后经SDS-PAGE验证，在相对分子质量55 000附近显示出一条单一的蛋白条带(图3A)。

2.3 酶联免疫吸附反应以及蛋白印迹实验

ELISA验证黄花蒿花粉烯醇化酶与过敏患者血清中IgE结合活性，在38份蒿属过敏患者血清中有9份OD值大于cut off值(cut off值=阴性血清反应吸光度的平均值+3×阴性血清吸光度标准偏差)，其IgE结合率为24%(9/38)(图3B)。利用免疫印迹对黄花蒿花粉烯醇化酶的IgE结合活性进一步验证，发现9份ELISA阳性结合血清中，5份可以在免疫印迹中显示出阳性结合条带(图3C)。

2.4 抑制性酶联免疫吸附反应

在黄花蒿花粉粗提物和重组蛋白浓度为1 μg/mL时，花粉提取物与重组烯醇化酶可分别抑制96.00%和11.83%血清IgE与花粉提取物的结合(图3D)。

3 讨论

蒿属花粉被认为是我国最重要的室外过敏原之一[3]。黄花蒿花粉作为三大蒿属致敏花粉中的一员[4]，根据WHO/IUIS数据库仅有4种过敏原分子已被鉴定，分别是A.annua1(防御素样蛋白)[7]、A.annua2(病程相关蛋白)[7]、A.annua3(脂质运载蛋白)[7]和A.annua7(半乳糖氧化酶)[7-8]。本研究通过对黄花蒿花粉转录组学测序和蛋白组学