雌激素受体α/β基因表达与胆囊胆固醇结石形成相关性研究

杜国涛， 王 青， 赵伟伟， 张兆波， 孙 悦， 赵鹏程， 刘建中

沧州市人民医院 1.肝胆外科；2.胃肠外科；3.检验科；4.超声科，河北 沧州 061000

胆囊胆固醇结石属于消化系统常见疾病，好发于成年女性，近年来发病率呈升高的趋势。随着病程延长，其有可能演变成胆囊癌及胆道系统恶性肿瘤，危及患者生命安全[1]。有研究发现，雌激素可以通过肝雌激素受体(estrogen receptor，ER)诱发胆结石形成，但是目前临床对于ERα或ERβ基因表达与胆囊胆固醇结石形成之间的关系少见报道[2]。本研究旨在探讨ERα或ERβ基因表达与胆囊胆固醇结石形成之间的关系。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取自2015年10月至2018年6月于沧州市人民医院接受手术治疗的60例胆囊胆固醇结石患者纳入B组，另选取60例因胆囊炎或肝血管瘤需要实施手术治疗的患者纳入A组。纳入标准：(1)胆囊结石、胆囊炎、肝血管瘤患者的诊断标准参考人民卫生出版社《外科学》第7版中的标准；(2)患者经CT、超声及磁共振胰胆管成像检查确诊；(3)患者年龄19～79岁。排除标准：(1)肝、胆道恶性肿瘤；(2)因寄生虫病导致的结石疾病；(3)一般资料缺失，无法进行统计；(4)长期酗酒；(5)近2个月服用调血脂药物史。本研究经医院伦理委员会批准。所有患者均签署知情同意书。

1.2 ERα mRNA和ERβ mRNA表达检测方法 获取肝组织总RNA并提取cDNA，采用美国GIBCO公司提供的Trizol试剂盒提取总RNA，在贝克曼D640U紫外分光光度计测定260 nm和280 nm下波长的A值，比值在1.6～1.8之间提示RNA纯度高。在1%琼脂糖凝胶电泳下鉴定RNA完整性，稀释RNA 1 μg/μl，合成cDNA，在-80℃下保存，采用Primer Express软件设计引物，上游引物序列：TCTTGGACAGGAACCAGGGA；下游引物序列：CGAGATGTAGCCAGCAGC。采用MedProbe公司提供的计算机系统开展测定，聚合酶链式反应产物经溶解曲线和琼脂糖凝胶电泳确定特异性，反应条件：预变性95℃、15 min，变性95℃、10 s，退火59℃、20 s，进行40个循环，终末延伸72℃、32 s，结束后读取Ct值，结果采用 2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

1.3 一般资料的收集及检测 收集两组患者的年龄、性别、体质量指数、吸烟、饮酒、高血压、糖尿病、血清总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、瘦素、胆汁中总胆固醇及总胆汁酸含量。抽取患者空腹静脉血3 ml，以2 000 r/min离心30 min后分离血清，采用日立7600型全自动生化分析仪对患者血脂瘦素、胆汁中总胆固醇及总胆汁酸含量进行测定，试剂盒为南京建成生物制品有限公司提供。用碳酸盐包被缓冲液，将抗体稀释至蛋白质含量为1～10 μg/ml，在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1 ml，4℃过夜。次日用洗涤缓冲液洗3次，每次3 min。加一定稀释的待检样品0.1 ml于上述已包被的反应孔中，置37℃孵育1 h。各反应孔中加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1 ml，37℃孵育0.5～1.0 h。洗涤加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1 ml，37℃ 10～30 min。于各反应孔中加入2 mol/L硫酸0.05 ml终止反应后判读结果。

2 结果

2.1 两组患者肝组织中ERα mRNA和ERβ mRNA表达比较 B组患者肝组织中ERα mRNA、ERβ mRNA表达强度均显著高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 两组患者一般资料比较 B组患者血清甘油三酯、总胆固醇、瘦素、胆汁总胆固醇水平均高于A组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 多因素Logistic回归分析结果 患者的血清甘油三酯、瘦素、胆汁总胆固醇水平增高，肝组织中ERα mRNA、ERβ mRNA表达上调是发生胆囊胆固醇结石的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表1 两组患者肝组织中ERα mRNA、ERβ mRNA表达比较

表2 两组患者一般资料比较

表3 Logistic回归分析

3 讨论

胆石症属于临床常见的消化系统疾病，可继发胆囊炎、胆管炎、胰腺炎，以及胆道肿瘤等多种疾患，危害患者身体健康，造成严重的社会经济负担[3-4]。肝分泌过多的胆固醇是结石形成的主要病理基础，胆固醇过饱和导致胆固醇晶体沉淀，并最终形成肉眼可见的结石[5-6]。胆固醇结石发生和发展受到基因、环境及遗传因素相互调控，属于多因素决定的复杂性疾病。流行病学调查发现，种族差异和遗传异质性在胆固醇结石发生和发展过程中具有重要的作用[7]。目前，血清甘油三酯、总胆固醇、瘦素、胆汁总胆固醇水平已被证实在促进胆固醇结石发展中具有重要的作用。胆汁酸是胆汁的主要组成成分，是胆固醇在肝中降解的代谢产物，胆汁酸不仅在胆固醇代谢及胆固醇的溶解中发挥重要作用，而且还影响食物脂类的消化、吸收。胆固醇的排泄受胆固醇与卵磷脂的相对比例的影响，当胆固醇与胆汁酸及卵磷脂的比值增高时，就会导致胆固醇过饱和，以结晶的形式析出，形成结石[8]。同时，胆结石患者体内还存在血脂紊乱，高密度脂蛋白还会参与机体胆固醇逆转运，将机体内游离的胆固醇转运至肝，优先用于合成胆汁酸，其参与转运的高密度脂蛋白胆固醇是胆汁内胆固醇的主要来源，在一定条件下参与形成胆固醇结石[9-10]。

本研究分析了肝组织中ERα mRNA、ERβ mRNA的表达强度。ERα、ERβ可以发挥基因调节作用，调节下游靶基因。有研究发现，17β-雌二醇主要通过雌激素受体对靶基因转录调控，在胆汁胆固醇的生物合成中具有重要作用[11]。另有研究发现，胆固醇结石发病同ERα上调有关，但是与ERβ无关，考虑是由于ERα和ERβ具有不同的转录激活结构域及组织分布特异性相关。本研究结果显示，胆固醇结石发生与Erβ相关，原因可能为ERβ参与了ERα高表达人群胆固醇结石发生的遗传性[12-13]。本研究中，B组患者肝组织中的ERα mRNA、ERβ mRNA表达强度显著高于A组，提示在胆囊胆固醇结石患者中存在ERα mRNA、ERβ mRNA表达上调；B组患者的血清甘油三酯、总胆固醇、瘦素、胆汁总胆固醇水平均高于A组，提示在胆囊胆固醇结石患者中血脂表达异常；Logistic回归分析发现，血清甘油三酯、瘦素、胆汁总胆固醇水平增高、肝组织中ERα mRNA、ERβ mRNA表达上调是发生胆囊胆固醇结石的独立危险因素，提示了血脂异常、肝组织中的ERα mRNA、ERβ mRNA表达升高会导致胆囊胆固醇结石高发。

综上所述，肝组织中ERα mRNA、ERβ mRNA表达上调与胆囊胆固醇结石的形成密切相关。