非复制型弓形虫的构建及其对小鼠致病性分析

任 超 王超越 刘贤勇 索 勋*

(1.中国农业大学 动物医学院，北京 100193； 2.天津农学院 动物科学与动物医学学院/天津市农业动物繁育与健康养殖重点实验室，天津 300384)

敲除弓形虫的氨甲酰基磷酸合成酶II(Carbamoyl phosphate synthetase II，CPSII)基因，阻断嘧啶从头合成途径，构建cps1-1虫株，能够激发宿主产生良好的免疫保护力，成为潜在的弓形虫减毒活疫苗[1]，但是由于cps1-1虫株存在嘧啶补救途径，能够在机体内缓慢增殖，虫体的毒力会有返强的机会，临床应用会存在极大的风险。为此，2010年Bzik研究团队将弓形虫的乳清酸核苷-5’-单磷酸脱羧酶(Orotidine-5’-monophosphate decarboxylase，OMPDC)和尿嘧啶核苷磷酸化酶(Uridine phosphorylase，UP)基因进行双敲除，不仅阻断了嘧啶从头合成途径，而且通过体外调节尿嘧啶的浓度，能够控制嘧啶补救途径，获得非复制型尿嘧啶营养缺陷型弓形虫(Nonreplicating toxoplasma uracil auxotrophs，NRTUAs)[2-3]。

NRTUAs具有独特的表型，在哺乳动物体内不能增殖，只能入侵机体细胞，而NRTUAs只有在体外添加尿嘧啶的培养基中才能正常裂殖生殖，否则只能入侵细胞，不能增殖，进而降低弓形虫的毒力和致病性，为临床应用提供安全保障[3]。

研究发现，NRTUAs能够调节宿主的免疫系统，激发宿主产生针对弓形虫的细胞免疫应答，并且免疫虫体经过5 d左右就能被机体的免疫系统清除[4-5]。与细菌和病毒疫苗载体相比，NRTUAs首次免疫1万个虫体就可以激发宿主产生保护性免疫应答，对抗野生型弓形虫的再感染[6-8]，说明NRTUAs可作为潜在的弓形虫候选疫苗株，未来有希望应用于家畜养殖业。虽然NRTUAs在小鼠体内可被清除，但如果大剂量免疫NRTUAs，宿主细胞是否会将所有的虫体清除？局部组织器官是否会发生病理变化？因此，确定NRTUAs的致病性至关重要。

本研究以△KU80株为背景虫株，利用CRISPR-Cas9技术，对OMPDC和UP基因进行双敲除，构建NRTUAs虫株，鉴定NRTUAs的表型并将NRTUAs株感染小鼠，通过分析NRTUAs株对小鼠的致死性以及各器官的病理变化来研究NRTUAs对小鼠的致病性，为NRTUAs在家畜养殖中作为抗弓形虫疫苗株的应用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试验动物

5周龄SPF级昆明小鼠60只，体重为20±2 g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲料充足，饮水不限，健康状况良好。

1.1.2细胞与虫株

非洲绿猴肾细胞(Vero)、人包皮成纤维细胞(HFF)和△KU80株，由中国农业大学国家动物寄生原虫实验室保存。

1.2 方法

1.2.1敲除载体的构建

参考Toxo DB数据库(http:∥www.toxodb.org)中RH虫株的基因组信息，应用http:∥grna.ctegd.uga.edu/网站设计OMPDC基因和UP基因的特异single guide RNA(sgRNA)序列。然后以pSAG1::Cas9 GFP-U6::sgUPRT为模板，分别通过引物gOMPDC-F/R和gUP-F/R以PCR扩增的方式替换模板质粒中的sgUPRT，获得识别OMPDC和UP靶点的敲除质粒；分别利用引物KO OMPDC-F1/R1/F2/R2和KO UP-F1/R1/F2/R2来扩增获得OMPDC和UP基因的5’UTR和3’UTR同源臂，并将OMPDC基因5’UTR、DHFR-YFP和OMPDC基因3’UTR3个片段连接，构建用于替代阻断OMPDC编码区的同源重组模板，同时将UP基因5’UTR、CAT-mCherry和UP基因3’UTR3个片段连接，构建用于替代阻断UP编码区的同源重组模板。

1.2.2敲除虫株ΔUP的获得与筛选鉴定

将弓形虫ΔKU80虫株进行富集和纯化，溶于适量电转液，使虫体的终浓度为2×107个/mL。调节电转仪，参数为2 050 V电压，电阻无穷大，电容25 μF，使用4 mm电转杯。取700 μL虫体加入电转杯中，将10 μg敲除质粒和50 μg同源重组模板加入电转杯中混匀，将电转杯放入安全操作池，启动程序，电转完毕后，电转杯静止20 min。将电转完毕的弓形虫加入新鲜培养的HFF细胞中，培养24 h后，更换细胞培养液，加入终质量浓度为 50 pg/mL 的氯霉素进行初步筛选，接种后每天观察各孔虫株生长状态，传至第六代时，可以观察到红色荧光和噬斑出现；当红色荧光和噬斑出现比例占细胞80%面积时，用细胞刷刮起细胞，注射器反复推注破碎细胞释放弓形虫，收集弓形虫继续进行氯霉素筛选传代，当敲除虫体的发光率稳定时，说明替换模板已成功插入弓形虫的基因组中，然后通过有限稀释法进行单克隆虫株的筛选，接种到96孔板内培养，直至虫株长成噬斑，挑出UP基因缺失的单克隆抗性虫株进行扩大培养，提取敲除虫株的基因组，利用引物UP 5-F/R和UP 3-F/R进行重组同源臂上下游PCR鉴定，利用引物UP I1-F/R和UP I2-F/R进行内源性UP位点缺失PCR鉴定，鉴定正确的敲除虫株ΔUP用于OMPDC基因敲除。

1.2.3敲除虫株ΔOMPDC的获得与筛选鉴定

敲除虫株的获得与筛选鉴定过程同1.2.2，电转完毕时，将弓形虫加入新鲜培养的HFF细胞中，细胞培养液中含250 μmol/L尿嘧啶。培养24 h后，更换细胞培养液，加入浓度为1 μmol/L的乙胺嘧啶进行初步筛选，接种后每天观察各孔虫株生长状态，传至第五代时，可以观察到黄色荧光和噬斑；单克隆鉴定时，提取敲除虫株的基因组，利用引物OMPDC 5-F/R和OMPDC 3-F/R进行重组同源臂上下游PCR鉴定，利用引物OMPDC I1-F/R和OMPDC I2-F/R进行内源性OMPDC位点缺失PCR鉴定，鉴定正确的敲除虫株ΔOMPDC用于后续实验。

1.2.4敲除虫株ΔOMPDCΔUP(NRTUAs)的获得与筛选鉴定

敲除虫株的获得与筛选鉴定过程同1.2.2，将弓形虫ΔUP株进行富集和纯化用于敲除，当电转完毕的弓形虫加入新鲜培养的HFF细胞中，细胞培养液中含250 μmol/L尿嘧啶。培养24 h后，更换细胞培养液，加入终质量浓度为50 pg/mL的氯霉素和1 μmol/L的乙胺嘧啶进行初步筛选，接种后每天观察各孔虫株生长状态，传至第五代时，可以观察到黄色荧光、红色荧光和噬斑；单克隆鉴定同1.2.3，鉴定正确的敲除虫株NRTUAs用于后续实验。

1.2.5噬斑试验

将HFF细胞铺满12孔细胞培养板，收集NRTUAs株和△KU80株，分别接种70个速殖子至HFF细胞，其中，NRTUAs株和△KU80株分别接种在含有或不含250 μmol/L尿嘧啶的细胞培养液中，培养7 d，观察，吸弃培养基，用PBS轻轻洗去释放到胞外的虫体。每孔加入4%多聚甲醛1 mL，室温固定20 min。每孔再加入1%结晶紫染色1～2 mL，室温染色1 h，用PBS充分洗涤。肉眼可见未着色的噬斑，扫描记录。

1.2.6非复制型弓形虫对小鼠的致病性研究

将雌鼠随机分成3组，每组10只，在试验第0天，各组以腹腔注射的方式分别感染NRTUAs株和△KU80株，速殖子悬液浓度为107个/mL，感染剂量为0.1 mL/只，同时腹腔注射等剂量的无菌PBS为空白对照。雄鼠处理方式同雌鼠。

每日观察各组小鼠的精神状态，记录死亡情况，对死亡小鼠即刻剖检，在试验第40天剖检剩余小鼠，采集所有小鼠的心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏、胸腺、脑、卵巢或睾丸，用10%中性福尔马林固定液进行组织固定，按照常规方法制备病理组织切片并进行HE染色，对小鼠各器官进行病理组织学观察和分析。

2 结果与分析

2.1 敲除载体的构建

以PCR扩增方式替换模板质粒中的sgUPRT，分别获得识别OMPDC和UP靶点的sgRNA基因片段(图1(a))，用于构建OMPDC和UP基因的敲除质粒。

通过PCR扩增，分别获得OMPDC和UP基因的5’UTR和3’UTR同源臂(图1(b))，并进一步构建替代阻断OMPDC和UP编码区的同源重组模板(图1(c))。

2.2 敲除虫株ΔUP的获得与筛选鉴定

分别提取NRTUAs株和△KU80株的基因组DNA为模板，NRTUAs株以引物OMPDC 5-F/R和OMPDC 3-F/R鉴定均为阳性，△KU80株均为阴性；NRTUAs株以引物OMPDC I1-F/R和OMPDC I2-F/R鉴定均为阴性，△KU80株均为阳性，说明NRTUAs株针对OMPDC基因的同源臂与基因组发生同源重组，OMPDC基因敲除成功(图1(d))；NRTUAs株以引物UP 5-F/R和UP 3-F/R鉴定均为阳性，△KU80株均为阴性；NRTUAs株以引物UP I1-F/R和UP I2-F/R鉴定均为阴性，△KU80株均为阳性，说明NRTUAs株针对UP基因的同源臂与基因组发生同源重组，UP基因敲除成功(图1(e))。

荧光倒置显微镜下观察，ΔOMPDC株自发黄色荧光，对乙胺嘧啶产生抗药性(图2(a))；ΔUP株自发红色荧光，对氯霉素产生抗药性(图2(b))； NRTUAs株自发黄色和红色双荧光，能够对乙胺嘧啶和氯霉素产生抗药性(图2(c))，说明OMPDC和UP基因敲除成功。

2.3 敲除虫株的表型鉴定

噬斑试验主要用于评价弓形虫在细胞内的整体生长情况。NRTUAs在不含尿嘧啶的培养基中不能形成噬斑，当培养基中添加尿嘧啶后，NRTUAs能够形成噬斑，而无论培养基中是否含有尿嘧啶，△KU80株均能形成噬斑(图3)。上述结果说明OMPDC和UP基因双敲除抑制弓形虫虫体的生长，通过体外尿嘧啶供给，能够恢复敲除虫体的生长能力。

(a)ΔOMPDC株自发黄色荧光，在含有乙胺嘧啶的培养基中能够生长；(b)ΔUP株自发红色荧光，在含有氯霉素的培养基中能够生长；(c)NRTUAs株自发黄色和红色双荧光，在含有乙胺嘧啶和氯霉素的培养基中能够生长。比例尺=20 μm(a) ΔOMPDC strains spontaneously fluorescing yellow can replicate in the medium with pyrimidine； (b) ΔUP strains spontaneously fluorescing red can replicate in the medium with chloramphenicol； (c) NRTUAs strains spontaneously fluorescing yellow and red can replicate in the medium with pyrimidine and chloramphenicol. Bar=20 μm图2 敲除虫株的筛选Fig.2 Screening of knockout strains

图3 敲除虫株的表型鉴定Fig.3 Phenotypic identification of knockout strain

2.4 非复制型弓形虫对小鼠的致病性分析

雌鼠在感染后0～40 d内，NRTUAs组和PBS组均无小鼠死亡，生存率为100%；△KU80组在感染后第4、5和6天分别出现6、3和1只小鼠死亡，生存率均为0(图4(a))。雄鼠在感染后0～40 d内，NRTUAs组和PBS组均无小鼠死亡，生存率为100%；△KU80组在感染后第3、4、6天分别出现2、6、2只小鼠死亡，生存率均为0(图4(b))。上述结果说明NRTUAs虫株对小鼠无致死性。

2.5 非复制型弓形虫对小鼠各器官的病理分析

小鼠心脏病理组织学分析，各组的心肌纤维排列规整，胞浆丰富，胞质和胞核染色均匀，细胞间无充血和炎性细胞浸润(图5)。

小鼠肺脏病理组织学分析，NRTUAs组和PBS组肺组织结构清晰，肺泡壁和各级支气管结构完整，肺泡腔和各级支气管腔内无渗出物，各级支气管的粘膜上皮无变性坏死脱落，肺泡间隔未增厚，无炎性细胞浸润，肺泡壁毛细血管内少量红细胞；△KU80组肺泡间隔、支气管和血管周围充血、水肿，淋巴细胞、单核细胞和嗜中性粒细胞浸润，成纤维细胞和网状纤维增生，部分细胞发生肿胀变性，坏死崩解，形成小坏死灶和肺泡间隔炎，使肺间质增宽，呈现间质性肺炎病变(图5)。

(a)雌鼠感染NRTUAs的生存情况；(b)雄鼠感染NRTUAs的生存情况(a) Survival of female mice infected with NRTUAs； (b) Survival of male mice infected with NRTUAs strains图4 小鼠感染NRTUAs的生存曲线Fig.4 Survival of mice infected with NRTUAs

小鼠肝脏病理组织学分析，NRTUAs组和PBS组的肝小叶结构完整，肝细胞索和肝血窦结构清晰，肝细胞呈多边形，核居中，肝脏被膜及汇管区小叶间动脉、小叶间静脉和小叶间胆管无明显病变；△KU80组肝脏小叶间静脉、叶下静脉和肝血窦淤血，肝脏呈现局灶性坏死，肝细胞核发生核浓缩、核碎裂和核溶解，导致原有组织结构不清楚，呈一片模糊红染无结构的状态，在坏死灶周围以巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞为主的炎性细胞浸润，在坏死灶附近的肝细胞发生颗粒变性、水样变性或脂肪变性(图5)。

小鼠肾脏病理组织学分析，NRTUAs组和PBS组的肾脏皮质髓质分界清晰，组织结构完整，肾小球形状规则，肾小管轮廓清楚，肾小管上皮细胞排列整齐，无变性坏死细胞；△KU80组肾小管上皮细胞颗粒变性、水泡变性和坏死，部分坏死组织碎片脱落入管腔，局部出血和炎性细胞浸润(图5)。

小鼠脾脏病理组织学分析，NRTUAs组和PBS组脾脏结构分明，红髓和白髓分界清楚，脾细胞排列规则，中央动脉周围密布淋巴细胞；△KU80组脾脏原有结构消失，红髓充盈大量血液，脾脏内实质细胞发生变性坏死，脾小梁的结缔组织和平滑肌纤维也出现不同程度的肿胀和溶解(图5)。

小鼠胸腺病理组织学分析，NRTUAs组和PBS组胸腺皮质、髓质结构分明，皮质较厚，密布胸腺细胞，染色较深，髓质含有很多上皮细胞，染色较浅；△KU80组胸腺的正常组织结构消失，胸腺内淤血，实质细胞发生变性坏死(图5)。

小鼠大脑病理组织学分析，NRTUAs组和PBS组脑组织结构正常，神经细胞胞浆透明，细胞核居中，呈圆形或椭圆形，核仁清晰，细胞结构完整，间质无水肿；△KU80组软脑膜及脑组织中血管充血，软脑膜及浅层脑组织有大量炎性细胞浸润，浅层脑组织液化坏死，在变性坏死的神经细胞周围可见神经胶质细胞呈弥漫性或局灶性增生，局部性增生的神经胶质细胞聚集成大小不等的集团，形成胶质细胞小结(图5)。

雌鼠卵巢病理组织学分析，NRTUAs组和PBS组卵巢组织结构层次清晰，卵泡数量丰富，各级卵泡轮廓清晰可见，并有大量黄体分布；△KU80组卵巢组织呈现凝固性坏死，卵泡和黄体的细胞发生变性坏死，结缔组织增生(图5)。

雄鼠睾丸病理组织学分析，NRTUAs组和PBS组睾丸曲细精管管壁完整，上皮细胞排列紧密，各级生精细胞排列整齐而规则，官腔内可见数量不等的精子，曲细精管之间结缔组织结构完整，可见睾丸间质细胞；△KU80组睾丸组织呈现凝固性坏死，曲细精管管腔内成熟精子减少或消失，仅见精原细胞及初级精母细胞层，呈生精停滞的状态，大量生精细胞发生变性坏死，坏死细胞碎片存在于曲细精管官腔中，睾丸间质细胞坏死，结缔组织增生，充血(图5)。

卵巢比例尺=180 μm，其他器官比例尺=90 μm Ovary bar=180 μm, Others=90 μm图5 NRTUAs感染小鼠各器官的病理变化Fig.5 Pathological changes of organs in mice infected with NRTUAs

3 讨 论

本研究利用CRISPR-Cas9技术，分别设计OMPDC基因和UP基因的特异sgRNA序列，构建识别OMPDC和UP靶点的敲除质粒，提高敲除效率；在同源重组模板中，通过添加抗药基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)和红色荧光基因(mCherry)来提升UP基因的敲除效率，通过添加抗药基因二氢叶酸还原酶(DHFR)和黄色荧光蛋白基因(YFP)来提升OMPDC基因的敲除效率，在研究方法上比2010年Bzik研究团队构建NRTUAs株的筛选效率更高[2]。

尿苷-5′-单磷酸(UMP)是弓形虫三磷酸尿苷(UTP)合成的重要上游物质，UMP的合成影响DNA和RNA的合成，进而影响弓形虫的增殖[1-2]。UMP的合成有2个重要的途径，分别是嘧啶从头合成途径与嘧啶补救途径，OMPDC和UP分别是这2个途径中的关键酶[9]。缺失OMPDC基因，UMP从头合成途径被阻断，虫体不能利用自身代谢产物合成UMP；而缺失UP基因，嘧啶补救途径被阻断，虫体不能利用宿主的核苷酸代谢产物合成UMP[3]。当体外添加尿嘧啶时，在尿嘧啶磷酸核糖转移酶的作用下尿嘧啶生成UMP，使虫体能够继续增殖，因此，在噬斑试验中，未加尿嘧啶的培养基，NRTUAs株不增殖，未见噬斑形成，而添加尿嘧啶的培养基，NRTUAs株能够增殖，说明构建的NRTUAs株不能在体外增殖，而NRTUAs株在添加尿嘧啶的培养基中能够增殖，与2010年Bzik研究团队构建的NRTUAs表型一致[2]。

弓形虫RH株为Ⅰ型强毒株，昆明小鼠对RH株非常敏感，其感染性强，急性致死率高[10]。△KU80株保留了RH株的毒力和致病性，对昆明小鼠的致死性极强[11]，所以感染△KU80株的小鼠，6日内全部死亡。NRTUAs株保留了RH株的抗原性和入侵有核细胞的能力，但不能在小鼠体内增殖，进一步降低了NRTUAs株对小鼠的致死性[3]。在本研究中，NRTUAs株腹腔感染小鼠，40 d 内未见异常，生存率为100%，且NRTUAs组与PBS组的各器官组织学形态一致，初步证实构建的NRTUAs对小鼠无致死性，且感染NRTUAs的小鼠各器官无病理变化。

综上所述，本研究以△KU80株为背景虫株，利用CRISPR-Cas9技术，通过导入荧光基因和抗药基因共同筛选，PCR鉴定获得NRTUAs虫株，噬斑试验表明本次构建的NRTUAs表型与2010年Bzik研究团队构建的NRTUAs表型一致，感染NRTUAs的小鼠全部存活，各器官无病理变化，说明NRTUAs对小鼠安全性较高，为NRTUAs在家畜养殖中作为抗弓形虫疫苗株进行深入研发提供参考。