基于GC-MS结合化学计量学的浓香型白酒分类方法

胡雪，李锦松，唐永清，张良，钱宇, , 3*，赵金松,4*

1(四川轻化工大学 生物工程学院，四川 自贡，643000)2(泸州老窖集团有限责任公司，四川 泸州，646000) 3(四川大学 化学学院，四川 成都，610064)4(川酒集团，四川 成都，610000)

中国白酒是世界六大蒸馏酒之一，是以粮物为原料，大曲、小曲或麸曲及酒母等为糖化发酵剂，经蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的，具有悠久的历史，在国内外都享有盛誉[1]。白酒中的风味成分含量极低，仅占总质量的1%～2%[2]。目前，白酒中已知的风味化合物超过1 000种[3]。由于酿造工艺、生产原料、窖藏条件等的不同造就了这些微量和痕量风味物质的种类和含量的差异，决定了白酒的风格、香型、品质。

近年来，GC、GC-MS、电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma massspectrometry，ICP-MS)、HPLC、近红外(near infrared spectrometry，NIR)等仪器在酒类饮料研究中广泛应用[4-7]。鉴于GC-MS方法超高的分离能力和对未知化合物准确的鉴定能力已被大量应用于酒类饮料的掺假识别[8]、身份鉴别[9]、年份酒鉴定等研究并取得了一定成果[10-12]。但利用GC-MS方法结合化学计量学的方法对浓香型白酒分类的研究还相对较少。

随着各种检测技术的不断成熟，白酒的检测方法已不再阻碍对其风味物质的定性定量研究，找到一种有效的数据处理和分析方法才是目前面临的问题。聚类分析(hierarchical cluster analysis，HCA)、主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘判别分析(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)、人工神经网络(artificial neural networks，ANN)和支持向量机(support vector machine，SVM)等化学计量学方法通常是结合各种检测技术用于食品药品等的分析研究[13-16]。ZHENG等[17]利用GC-MS结合PCA和PLS-DA对不同品牌的浓香型原酒进行了有效区分。WU等[18]利用紫外可见光谱结合PCA和SVM以及PLS-DA对不同产地的米酒进行区分，其正确率高达100%。WU等[19]利用多种同位素和金属元素结合多种化学计量学的分析方法能对进口红酒的产地进行有效的验证分析。综上所述，利用化学计量学结合各种检测技术能对数据隐含的更深层次的信息进行有效挖掘和分析。

本实验以6个不同品牌的31种浓香型白酒为研究对象，以GC-MS为检测手段，利用33种共有风味物质结合HCA、PCA和PLS-DA等化学计量学的方法，分析了浓香型白酒中风味物质间的差异，可为浓香型白酒快速分类以及多样品间风味成分比对分析提供理论依据和方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试验材料为6个不同品牌的浓香型白酒，所有酒样均购于京东官方自营旗舰店，样品具体信息见表1。

表1 浓香型白酒酒样信息Table 1 The detail of the strong-flavor Baijiu samples

风味物质标准品(色谱级及以上)：正丙醇、仲丁醇、正丁醇、2-甲基丙醇、乙酸乙酯、乙酸、异戊醛、2-戊酮、丙酸乙酯、异戊醇、正戊醇、丁酸乙酯、正己醇、戊酸乙酯、己酸、己酸乙酯、己醛二乙缩醛、庚酸乙酯、己酸丁酯、丙酸、丁酸、庚酸、辛酸、叔戊醇，天津光复化学试剂有限公司；乙缩醛、乳酸乙酯、乙酸正戊酯、无水乙醇，北京坛墨质检标准物质中心；2-甲基丁酸乙酯、丁醛二乙缩醛、乙酸己酯、己酸己酯、十六酸乙酯，百灵威科技有限公司；己酸丙酯、亚油酸乙酯，阿拉丁试剂(上海)有限公司；C7-C40正构烷烃，北京曼哈格生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

TSQ8000三重四极杆气相色谱质谱、AI1310多功能自动进样器，美国Thermo Fisher Scientific公司；HP-5毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，美国Agilent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 定性分析

结合风味物质的保留时间指数(retention index，RI)和NIST 12质谱库进行定性分析。

1.3.2 定量分析

白酒中风味成分的定量分析方法参考国家标准GB/T 10345—2007《白酒分析方法》。将待测风味成分的标准物质精确量取并用60%(体积分数)乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中，所有待测风味成分的体积分数均为0.02%。在样品分析前，首先对混合标准溶液进行分析，利用峰面积及标准物质的含量计算出每种风味化合物的校正因子。分别以乙酸正戊酯，2-乙基丁酸，叔戊醇作为酯类、酸类及醇类和其他类别风味成分的内标物。

1.3.3 GC-MS检测方法

GC条件：初始温度为40 ℃，保持1 min，以20 ℃/min的速率升高至120 ℃，保持1 min，以40 ℃/min速率升高至290 ℃；载气为He, 柱流量 1.0 mL/min；进样口温度250 ℃, 进样量：1 μL，分流比 50∶1。

MS条件：电离方式EI，电子能量70 eV；离子源温度280 ℃；传输线为260 ℃；扫描方式为全扫描；扫描质量范围(m/z)30～550。

1.4 数据统计与分析

利用ChemPattern软件(科迈恩北京科技有限公司)和SPSS 24.0对数据进行化学计量学分析，Excel 2016、Origin 2018软件对测定数据进行整理统计和画图分析。

2 结果与分析

2.1 精密度和回收率分析

分析酒样前，进空白样品(甲醇)做对照。取配制好的混合标准溶液连续6次平行测试，统计任意一个风味成分的保留时间和峰面积，结果显示峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)<2%，峰保留时间的 RSD 值均< 0.1%。在样品风味成分定量结果的基础上进行加标回收实验，加标回收率为90.83%～104.35%，表明实验仪器稳定且根据本实验方法测得的结果可信。

2.2 风味物质的定性与定量

利用GC-MS，采取直接进样的方式，在15 min内共检测到112种化合物。在扣除乙醇峰后，利用面积归一化法，以峰高>0.5%为界，共筛选出33种含量较高的风味成分作为研究对象进行定量分析，结果见表2。其中酯类14种，醇类8种，酸类6种和5种醛酮类物质。酯类是浓香型白酒中的主要呈香物质，具有令人愉悦的水果香气[20]，以己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯为主，但在不同品牌的酒样中4类酯的含量差异较大，JSY和YJGJ中己酸乙酯的含量相较于其他品牌略低，YJGJ酒样中乙酸乙酯含量相较于其他品牌稍低，所有样品的乳酸乙酯和丁酸乙酯的含量相差不大。醇类为发酵过程中氨基酸脱氨或糖脱羧产生[21]，在6个品牌中WLY、YH、JSY样品中的醇类物质含量相较于SXTB、LZLJ更高。酸类则为糖类发酵的产物[20]，浓度较低时具有一定的奶酪香气，能够增加白酒香气的复杂性，而浓度较高具有明显的酸败味。由表2可知，不同品牌样品的酸类物质在含量上相差不大，以乙酸和己酸为主。以乙缩醛为代表的羟基类化合物大量存在于样品中，主要是对风味及口感有影响[20]，研究对象中WLY和YH酒样的羟基类化合物略高于其他品牌白酒。然而，从测试结果统计来看，单一或者多种风味成分的含量及量比关系并不能实现对白酒品牌的区分和鉴别，因此，需要借助其他数据分析手段对定量结果进行挖掘以获得更多的可用信息来得到更好的分类效果，如PCA，HCA，ANN，PLS-DA等化学计量学手段。

表2 不同品牌酒样中风味物质含量Table 2 The content of flavoring compounds in different brands of liquor samples

2.3 聚类分析

HCA是将研究对象按照相似度进行自然聚集的一种技术，为一种无监督模式识别方法，是将研究对象分为相对同质群组的统计分析技术[22]。在本实验中，以33种风味物质含量为变量，对数据进行标准化处理，其聚类分析结果显示(图1)，6个品牌的31个浓香型白酒被聚成2大类和6个小类，相同品牌不同类别的酒样能按照品牌单独聚集为一类，不同品牌间样品具有明显差异，说明聚类分析对浓香型白酒区分具有一定的指导意义。

2.4 主成分分析

PCA是一种在无监督模式下对多个变量通过线性变换以选出较少个数重要变量的一种多元统计分析方法[23]。在对实验样品进行PCA之前，使用相关系数矩阵对数据进行适应性检验，结果显示33种风味物质呈显著正相关(P<0.05)，表明酒样中的风味物质间的相关性较强，能用PCA方法对其进行处理。利用PCA对样品的33种共有风味成分进行分析，其中前3个主成分累计方差贡献值为72.95%，基本保留了原来变量的信息。由PC1、PC2、PC3的得分构建的三维和二维散点图(图2)可知，6个不同品牌的浓香型白酒能被较好分类，每个品牌间样品的聚集程度与HCA得到的结果一致，表明在对白酒品牌的鉴别时，PCA和HCA可以相互验证。

图1 不同品牌浓香型白酒的聚类分析Fig.1 Hierarchical cluster analysis in different brands of strong-flavor Baijiu samples

a-PC1，PC2，PC3三维散点图；b-PC1，PC2散点图；c-PC1，PC3散点图图2 不同品牌浓香型白酒PCAFig.2 The PCA in different brands of strong-flavor Baijiu samples

2.5 偏最小二乘判别分析

在HCA和PCA的分析结果上，进一步利用PLS-DA对样品数据进行处理。PLS-DA是一种基于偏最小二乘回归算法的线性分类方法，该模型适用于多自变量并且强线性情况的分析和预测，能从数据内部的角度来解释所提取的主因子[24]。对6个品牌的浓香型白酒进行PLS-DA，提取的3个成分变量信息占总原始变量信息的74.19%，表明这3个成分可反映白酒中风味物质的总体情况。利用前3个成分的得分做三维散点(图3)，可得，PLS-DA的分类结果与HCA，PCA结果相似，都对研究样品进行有效鉴别和分类。随机从6个品牌中任意挑选1个样品作为 “测试集”，其余的25个酒样作为“训练集”，对测试集样本做判别，用判定结果与实际情况对比。判别结果如图4所示，测试集样本的预测结果准确率为100%，能有效地对不同品牌的酒样进行分类和鉴定。

图3 不同品牌浓香型白酒PLS-DAFig.3 The PLS-DA in different brands of strong-flavor Baijiu samples

图4 PLS-DA预测分类结果Fig.4 PLS-DA predictive classification result

2.6 不同品牌浓香型白酒风味差异原因分析

本次试验利用33种共有风味物质，多种化学计量学方法能将6个不同品牌的酒样有效分类。同时，在HCA、PCA和PLS-DA分析中，6个品牌按照接近程度可以概括为2大类：WLY和YH为一类，剩余样品为一类。WLY与YH的酒样更相近，而与同一产区的LZLG相距较远，造成这种现象的原因可能有以下几个方面：(1)生产原材料[25]。LZLG白酒酿造原料主要以单粮(高粱)为主，而WLY和YH等多采用多粮，原料包括高粱，大米，小麦，玉米，糯米等，但彼此之间的混合比例在不同酒厂也有差异，导致最终的风味和口感也稍有差异。(2)酿造工艺[26]。以LZLJ为例，LZLJ采用原窖法酿造，窖香浓郁，风味统一；WLY采用跑窖法，曲香、粮香突出，窖香偏弱；洋河采用“混蒸混烧、蒸五下四”的老五甑发酵工艺，酒质偏甜，绵性好。(3)窖池及其微生物群落等[27]。发酵用的窖池及其微生物群落的差异也会造成白酒风味存在一定差异，而微生物群落的分布与地质、水源、气候、环境、温度等密切相关。因此，造成不同品牌白酒风味差异的因素有很多，但每个品牌独特的原料配方及酿造工艺造就了每个白酒的特有风味和口感，因而，本文从白酒风味成分入手，利用多种化学计量学手段，能将不同品牌白酒进行有效区分和鉴别。

3 结论

采用GC-MS直接进样的分析方法对市售畅销的不同品牌浓香型白酒的风味物质进行了定性和定量研究，具有简单，快速，经济且对样品无损的优点。利用33种共有风味物质对所有样品进行HCA、PCA和PLS-DA。HCA，PCA能将6个不同品牌的酒样进行有效分离。PLS-DA也能将6个品牌的酒样区分开，且在判定结果中测试样本与训练样本的正确率均为100%。因此，利用GC-MS的检测技术结合多种化学计量学分析方法能对不同品牌的浓香型白酒进行有效的分类和鉴定。