响应面法优化浙贝母氨基酸提取工艺及含量测定

魏祖晨，赵顺鑫，周浓，谷文超，陈妍斌，陈群辉，张华*

1(重庆三峡学院 生物与食品工程学院，三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室，重庆，404120) 2(大理大学 药学与化学学院，云南 大理，671000)

浙贝母(FritillariathunbergiiMiq)主产于浙江及江苏地区，为百合科贝母属多年生草本植物。多以其鳞茎入药，具有清热化痰，散结消痈之疗效[1]。因其产地的不同，浙贝母会出现遗传差异性[2]。有研究表明，浙贝母含有丰富的皂苷和生物碱类成分[3-4]及氨基酸类成分[5]。近年来，随着对浙贝母药理研究的深入[6]，发现其有抑制癌细胞扩散的作用，抗癌疗效显著，这方面的研究受到了广泛的关注[7]。氨基酸是蛋白质的基本组成单元，同时也是人体代谢过程中的重要物质，它是人体必需营养成分之一，对疾病的治疗和康复具有积极作用[8]。有文献报道，浙贝母花期地上部分总氨基酸含量丰富[9]，测出含有17种氨基酸，其中谷氨酸和精氨酸含量较高，精氨酸在细胞增殖和分裂以及蛋白质合成方面发挥着重要的作用[10-11]。对于浙贝母氨基酸方面的研究主要集中在地上部分，但对浙贝母药用部位——鳞茎的氨基酸相关研究报道较少。

响应面分析，是指在多因素数量处理试验的分析中，分析试验指标与多个试验因素间的回归关系，因其方便快捷，结果可靠，目前在化学、生物学等领域占据重要地位[12]。陈文等[13]采用响应面分析法优化海参氨基酸提取条件。目前，氨基酸测定方法有氨基酸分析仪-柱后衍生法[14-15]、柱前衍生-蒸发光散射检测器法[16-17]和柱前衍生化-高效液相色谱法等[18-21]。氨基酸的衍生试剂较多，异硫氰酸苯酯(phenyl isothiocyanate，PITC)因其配制简单、操作方便，衍生后可直接进样，成为最常用的衍生试剂。因此，本文拟采用响应面法优化提取浙贝母鳞茎中氨基酸最优试验条件，并采用柱前衍生UPLC法测定其含有的氨基酸种类和含量，比较栽前栽后氨基酸含量的差别，以期为相关研究提供技术和理论支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备

ACQUITY UPLC H-Class超高效液相色谱仪(含PDA检测器，Empower 3色谱工作站)，美国Waters公司；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm)，美国Waters公司；HDL-4型离心机，江苏省金坛市鸿科科技有限公司；Vortex Genius 3型涡旋混合器，德国IKA公司；ME204E型万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；HN200型多功能氮吹仪，山东海能科学仪器有限公司；GZX-GF101-MBS型恒温电热干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司；UV-2450紫外-可见分光光度计，岛津企业管理(中国)有限公司；KQ-300B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；GM-0.33A隔膜真空泵，天津市津腾实验设备有限公司；MS105DV十万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司。

1.2 试剂

谷氨酸(Glu，批号GG202002，含量≥98%)、脯氨酸(Pro，批号PP202001，含量≥98%)、赖氨酸(Lys，批号LS201911，含量≥99%)、亮氨酸(Leu，批号LL201912，含量≥98%)、精氨酸(Arg，批号JA202005，含量≥99%)、异亮氨酸(Ile，批号YI191221，含量≥99%)、甘氨酸(Gly，批号VB202110，含量≥98%)，均购自BOMEI公司；苏氨酸(Thr，批号DST191010-135，含量≥99%)、缬氨酸(Val，批号DST190906-061，含量≥99%)、苯丙氨酸(Phe，批号DST190812-136，含量≥98%)、天门冬氨酸(Asp，批号DST190806-897，含量≥98%)、丙氨酸(Ala，批号DST190908-112，含量≥98%)、组氨酸(His，批号DST190720-069，含量≥98%)、丝氨酸(Ser，批号DST190901-190，含量≥98%)，购自成都德思特生物技术有限公司。

盐酸、三乙胺、乙酸钠、冰醋酸(均为分析纯)，成都科龙化工试剂厂；异硫氰酸苯酯(PITC，≥99%蛋白测序级)，麦克林试剂公司；乙腈(色谱纯)，德国默克公司；实验用水为怡宝纯净水。

1.3 样品来源

浙贝母新鲜鳞茎采自浙江、江苏及重庆3个省种植基地同一批大小基本一致的样品，经三峡库区道地药材绿色种植与深加工重庆市工程实验室(重庆三峡学院)周浓教授鉴定为百合科贝母属浙贝母(FritillariathunbergiaMig.)的新鲜鳞茎，样品来源为：浙江省宁波市千祥镇、浙江省磐安县新渥镇、江苏南通市张芝山镇和重庆市奉节县冯坪乡，按照栽前与栽后依次编号为Zq-1、Zh-1；Zq-2、Zh-2；Zq-3、Zh-3；Zq-4、Zh-4。

1.4 试验方法

1.4.1 响应面优化浙贝母氨基酸提取工艺

1.4.1.1 单因素变量考察

(1)水解时间对吸光度的影响

称取样品0.100 0 g于顶空瓶中，加入6 mol/L盐酸10 mL，超声处理30 min，密封。在110 ℃的恒温干燥箱中分别水解18、20、22和24 h后，取出，冷却至室温。将内容物过滤去除固体物，收集滤液定容至25 mL。

(2)超声时间对吸光度的影响

称取样品0.100 0 g于顶空瓶中，加入6 mol/L盐酸10 mL，分别超声处理20、30、40和50 min，密封。在110 ℃的恒温干燥箱中水解20 h后，取出，冷却至室温。将内容物过滤去除固体物，收集滤液定容至25 mL。

(3)水解温度对吸光度的影响

称取样品0.100 0 g于顶空瓶中，加入6 mol/L盐酸10 mL，超声处理30 min，密封。分别在100、110、120和130 ℃的恒温干燥箱水解20 h后，取出，冷却至室温。将内容物过滤去除固体物，收集滤液定容至25 mL。

(4)盐酸用量对吸光度的影响

称取样品0.100 0 g于顶空瓶中，分别加入6 mol/L盐酸6、8、10、12和14 mL，超声处理30 min，密封。在110 ℃的恒温干燥箱中水解20 h后，取出，冷却至室温。将内容物过滤去除固体物，收集滤液定容至25 mL。

1.4.1.2 Box-Behnken中心组合实验设计

经过单因素实验数据对比，每个因素选取4个对氨基酸影响较大水平。设计4因素3水平的Box-Behnken中心组合试验。采用陈文等[13]方法，在360 nm处测定样品吸光度并作为响应值，每组重复3次，取其平均值。

1.4.2 柱前衍生UPLC法浙贝母氨基酸含量测定

1.4.2.1 对照品溶液制备

精密称取Asp、Glu、Ser、Gly、His、Arg、Thr、Ala、Pro、Val、Ile、Leu、Phe、Lys对照品适量，用0.1 mol/L盐酸溶解并定容于5 mL容量瓶中，配制成质量浓度分别为0.369、0.335、0.315、0.339、1.087、1.838、1.378、0.171、0.109、0.348、0.724、1.293、1.076、0.695 mg/mL的对照品贮备溶液，即得。

1.4.2.2 供试品溶液制备

样品水解：准确称取0.100 0 g浙贝母样品粉末(过3号筛)于顶空瓶中，加入6 mol/L盐酸溶液10 mL，混合均匀，密封，放至110 ℃的电热鼓风恒温箱内水解20 h，取出，冷却至室温，过滤，滤液加蒸馏水定容至25 mL，混匀即得水解液。

样品衍生：取样品水解液400 μL于氮吹管中，放入氮吹仪中氮吹至干，除去高浓度盐酸溶液，加入纯净水400 μL复溶，加入1.0 mol/L三乙胺-乙腈溶液200 μL，涡旋混匀，再加入0.1 mol/L异硫氰酸苯酯-乙腈溶液200 μL，涡旋混匀，室温下衍生1 h，每隔20 min 涡旋振荡1次，衍生完成后加入正己烷800 μL，涡旋混匀，4 000 r/min离心5 min，弃去上清液，再重复操作2次，除去多余衍生试剂，过0.22 μm微孔滤膜即得样品溶液。

1.4.2.3 空白衍生溶液制备

取0.1 mol/L盐酸溶液400 μL于氮吹管中，按照“1.4.2.2”项下方法进行衍生萃取，即得空白衍生溶液。

1.4.2.4 色谱条件

色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(1.7 μm，2.1 mm×150 mm)；流动相：A为0.1 mol/L乙酸钠溶液(冰醋酸调pH=6.5)-乙腈(体积比97∶3)，B为乙腈-水(体积比4∶1)，梯度洗脱见表1。检测波长为254 nm，进样体积2 μL，柱温40 ℃。

表1 流动相梯度表Table 1 The gradient mobile phase program

2 结果与分析

2.1 响应面优化浙贝母氨基酸提取工艺结果

2.1.1 单因素变量试验结果

2.1.1.1 水解时间对样品氨基酸吸光度的影响

吸取1.4.1.1(1)滤液400 μL，按照1.4.2.2方法衍生，应用紫外-分光光度计测定其吸光度，所得结果如图1所示。由图1可知，随着水解时间的延长，吸光度逐渐增大，在20 h时，吸光度达到最大。之后，随着水解时间的继续延长，吸光度明显下降，因此最佳水解时间为20 h。

图1 水解时间对样品吸光度的影响Fig.1 Influence of hydrolysis time on sample absorbance

2.1.1.2 超声时间对样品吸光度的影响

吸取1.4.1.1(2)滤液400 μL，按照1.4.2.2方法衍生。应用紫外-分光光度计测定其吸光度，所得结果如图2所示。由图2可知，随着超声时间的延长，吸光度逐渐增大，在30 min时，吸光度达到最大。之后，随着超声时间的继续延长，吸光度明显下降，因此最佳超声提取时间30 min。

图2 超声时间对样品吸光度的影响Fig.2 Influence of ultrasound time on sample absorbance

2.1.1.3 水解温度对样品吸光度的影响

吸取1.4.1.1(3)滤液400 μL，按照1.4.2.2方法衍生，应用紫外-分光光度计测定其吸光度，所得结果如图3所示。由图3可知，随着水解温度的增高，吸光度逐渐增大，在110 ℃时，吸光度达到最大。之后，随着水解温度的继续升高，吸光度明显下降，因此最佳水解温度为110 ℃。

图3 水解温度对样品吸光度的影响Fig.3 Influence of hydrolysis temperature on sample absorbance

2.1.1.4 盐酸用量对样品吸光度的影响

吸取1.4.1.1(4)滤液400 μL，按照1.4.2.2方法衍生，应用紫外-分光光度计测定其吸光度，所得结果如图4所示。由图4可知，随着盐酸用量的增大，吸光度逐渐增大，在8 mL时，吸光度达到最大。之后，随着盐酸用量的继续增大，吸光度明显下降，因此最佳盐酸用量为8 mL。

图4 盐酸用量对样品吸光度的影响Fig.4 Influence of hydrochloric acid dosage on sample absorbance

2.1.2 响应面优化试验结果

2.1.2.1 响应面试验回归方程拟合

根据单因素试验结果，氨基酸水解的最佳条件为：水解时间20 h、超声时间30 min、水解温度110 ℃及6 mol/L盐酸8 mL。因此以最佳条件为0水平，在左右两侧取-1和1水平进行响应面试验。试验数据采用Design Expert 8.0.6.1软件进行处理分析。拟合方程为：吸光度=1.63+0.017A-0.037B-0.025C-0.027D+0.024AB-0.042AC+0.028AD-0.024BC-0.031BD+0.056CD-0.038A2-0.085B2-0.036C2-0.093D2。

其中：A、B、C、D分别代表盐酸用量(mL)、超声时间(min)、水解时间(h)和水解温度(℃)。

表2 Box-Behnken响应面分析试验设计及结果Table 2 Box-Behnken response surface analysis test design and results

2.1.2.2 响应面试验优化分析

由图5可知，当超声时间不变时，随着盐酸用量的增加，吸光度逐渐增大，当盐酸用量为8 mL时，吸光度达到峰值。随后随着盐酸用量继续增大，吸光度又逐渐减小。同时，当盐酸用量不变时，随着超声时间的延长，吸光度逐渐增大，当超声时间为30 min时，吸光度达到峰值。随后随着超声时间的继续延长，吸光度又逐渐减小。等高线中的椭圆度较大，证明2个因素的交互作用对吸光度的影响显著。由表3可知，AB交互作用的P值<0.01，影响极显著。

图5 盐酸用量和超声时间对吸光度影响的等高线 及响应面Fig.5 Contour lines and response surface of the influence of hydrochloric acid dosage and ultrasound time on absorbance

表3 Design-Expert.V 8.06分析回归模型ANOVA结果Table 3 Design-Expert.V 8.06 analysis regression model ANOVA results

由图6可知，当水解时间不变时，随着盐酸用量的增加，吸光度逐渐增大，当盐酸用量为8 mL时，吸光度达到峰值。随后随着盐酸用量继续增大，吸光度又逐渐减小。同时，当盐酸用量不变时，随着水解时间的延长，吸光度逐渐增大，当水解时间为20 h时，吸光度达到峰值。随后随着超声时间的继续延长，吸光度又逐渐减小。等高线中的椭圆度较大，证明2个因素的交互作用对吸光度的影响显著。由表3可知，AC交互作用的P值<0.01，影响极显著。

图6 盐酸用量和水解时间对吸光度影响的等高线及响应面Fig.6 Contour and response surface of the influence of hydrochloric acid dosage and hydrolysis time on absorbance

由图7可知，当水解温度不变时，随着盐酸用量的增加，吸光度逐渐增大，当盐酸用量为8 mL时，吸光度达到峰值。随后随着盐酸用量继续增大，吸光度又逐渐减小。同时，当盐酸用量不变时，随着水解温度的增高，吸光度逐渐增大，当水解温度为110 ℃时，吸光度达到峰值。随后随着水解温度的继续增大，吸光度又逐渐减小。等高线中的椭圆度较大，证明2个因素的交互作用对吸光度的影响显著。由表3可知，AD交互作用的P值<0.01，影响极显著。

图7 盐酸用量和水解温度对吸光度影响的等高线 及响应面Fig.7 Contour and response surface of the influence of hydrochloric acid dosage and hydrolysis temperature on absorbance

由图8可知，当水解时间不变时，随着超声时间的延长，吸光度逐渐增大，当超声时间为30 min时，吸光度达到峰值。随后随着超声时间继续延长，吸光度又逐渐减小。同时，当超声时间不变时，随着水解时间的增高，吸光度逐渐增大，当水解时间为20 h时，吸光度达到峰值。随后随着水解时间的继续延长，吸光度又逐渐减小。等高线中的椭圆度较大，证明2个因素的交互作用对吸光度的影响显著。由表3可知，BC交互作用的P值<0.01，影响极显著。

图8 水解时间和超声时间对吸光度影响的等高线及响应面Fig.8 Contour and response surface of the influence of hydrolysis time and ultrasonic time on absorbance

由图9可知，当水解温度不变时，随着超声时间的延长，吸光度逐渐增大，当超声时间为30 min时，吸光度达到峰值。随后随着超声时间继续延长，吸光度又逐渐减小。同时，当超声时间不变时，随着水解温度的增高，吸光度逐渐增大，当水解温度为110 ℃时，吸光度达到峰值。随后随着水解温度的继续增高，吸光度又逐渐减小。等高线中的椭圆度较小，证明两个因素的交互作用对吸光度的影响不显著。由表3可知，BC交互作用的P值=0.944 4>0.05，影响不显著。

图9 超声时间和水解温度对吸光度影响的等高线 及响应面Fig.9 Contour and response surface of the influence of ultrasonic time and hydrolysis temperature on absorbance

由图10可知，当水解温度不变时，随着水解时间的延长，吸光度逐渐增大，当水解时间为20 h时，吸光度达到峰值。随后随着水解时间继续延长，吸光度又逐渐减小。同时，当水解时间不变时，随着水解温度的增高，吸光度逐渐增大，当水解温度110 ℃时，吸光度达到峰值。随后随着水解温度的继续增高，吸光度又逐渐减小。等高线中的椭圆度较大，证明2个因素的交互作用对吸光度的影响显著。由表3可以看出，CD交互作用的P值=0.034 5，影响显著。

图10 水解时间和水解温度对吸光度影响的等高线 及响应面Fig.10 Contour and response surface of the influence of hydrolysis time and hydrolysis temperature on absorbance

2.1.3 方差分析

由表3可知，该模型的P<0.01，证明该试验拟合方程所成模型极显著。与此同时，失拟项的P值>0.1，证明此模型与正交的结果，线性关系极好。标志着用此模型可以推断出最佳结果。R2=0.990 3，拟合度很好。CV=0.46%，置信度可观，误差较小。因此可以用此模型来预估试验结果，从而减少试验量。表3结果表明，除BD和CD的交互作用的影响不显著外，其余因素的影响都为极显著，证明这些因素及其交互作用对氨基酸提取的影响是极显著的。

2.2 柱前衍生UPLC法浙贝母氨基酸含量测定结果分析

2.2.1 方法学考察

2.2.1.1 线性关系考察

取“1.4.2.1”项下对照品储备液100、200、300、400、500 μL于5 mL容量瓶中，加0.1 mol/L盐酸溶液定容至刻度，配制成系列混合对照品溶液。取系列混合对照品溶液各400 μL，按“1.4.2.2”项下条件衍生，按“1.4.2.4”项下色谱条件进行测定，以各对照品浓度为横坐标(Y)，以峰面积为纵坐标(X)，绘制标准曲线，结果见表4，结果显示各个成分在线性范围内线性关系良好。

表4 14种氨基酸线性关系Table 4 The linearity relationships of 14 amino acids

2.2.1.2 精密度试验

取“1.4.2.1”项下混合对照品溶液衍生液400 μL，按“1.4.2.2”项下条件衍生，按“1.4.2.4”项下色谱条件连续进样6次，测得各氨基酸峰面积RSD值在1.74%～2.82%，结果表明仪器精密度良好。

2.2.1.3 重复性试验

取浙贝母鳞茎粉末(Zq-2)0.100 0 g，平行6次，按“1.4.2.2”项下条件水解衍生，按“1.4.2.4”项下色谱条件进行测定，测得各氨基酸峰面积RSD值为0.83%～2.88%，结果表明重复性良好。

2.2.1.4 稳定性试验

取浙贝母鳞茎样品(Zh-1)0.100 0 g，按“1.4.2.2”项下条件水解衍生，按“1.4.2.4”项下色谱条件在0、2、4、6、8 h进行测定，测得各氨基酸峰面积RSD值为1.43%～2.95%，结果表明浙贝母衍生液在8 h内稳定性良好。

2.2.1.5 加样回收率试验

取6份已知氨基酸含量的滇重楼根茎粉末(Zh-2)0.050 0 g，置于顶空瓶中，加各氨基酸对照品储备液适量，按“1.4.2.2”项下条件水解衍生，按“1.4.2.4”项下色谱条件进行测定，记录各成分峰面积，计算回收率和RSD，结果见表5。结果显示，各氨基酸平均加样回收率为95%～105%，RSD值为0.97%～2.78%，表明该方法准确可靠。

表5 加样回收率(n=6)Table 5 Recoveries (n=6)

2.2.2 样品测定

精密称取“1.3”项下的8份不同产地栽前及栽后浙贝母样品(过3号筛)0.100 0 g，按“1.4.2.2”项下条件水解衍生，按“1.4.2.4”项下色谱条件进行测定，带入标准曲线方程，计算14种氨基酸含量，结果见表6。空白衍生溶液、混合对照品及样品色谱图见图11。由图11可知，与标准品对照，样品中含有14种氨基酸。样品中各组分得到了较好的分离，进一步验证了色谱条件的可行性。

1-Asp;2-Glu;3-Ser;4-Gly;5-His;6-Arg;7-Thr;8-Ala;9-Pro;10-Val;11-Ile;12-Leu;13-Phe;14-Lys A-对照组；B-供试品；C-空白溶液图11 混合对照品、供试品及空白溶液UPLC色谱图Fig.11 UPLC chromatogram of amino acids of reference substances solution, sample solution and blank solution

由表6可知，不同产地浙贝母鳞茎中氨基酸含量存在一定差异，其中天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、异亮氨酸含量、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸含量分别为2.071～8.190、2.614～7.639、4.405～6.199、4.793～6.828、1.163～2.072、12.544～37.516、1.869～2.885、2.240～3.585、14.490～19.282、3.803～6.703、6.852～16.337、11.580～18.966、2.953～4.434、5.392～11.940 mg/g。4个产地栽前与栽后浙贝母样品中，精氨酸平均含量最高；脯氨酸和异亮氨酸平均含量较高。组氨酸含量最低。

表6 不同产地栽前栽后浙贝母中14种氨基酸含量(n=3) 单位：mg/g

2.2.3 独立样本t检验

采用SPSS 20.0软件对4个产地栽培前浙贝母和4个产地栽培后浙贝母鳞茎中14种氨基酸进行独立样本t检验分析，分析结果见表7。由表7可知，方差方程的Levene 检验可以看出，14种氨基酸方差相等(P>0.05)。均值方程的t检验可以看出，栽培前浙贝母与栽培后浙贝母鳞茎中14种氨基酸含量均无显著差异(P>0.05)。

3 结论

本文对氨基酸提取条件中的盐酸用量、超声时间、水解温度和水解时间4个因素，先进行了单因素考察。通过单因素考察初步确定了每个因素的最佳条件。为了进一步优化提取条件，我们采用了响应面法对这些因素进行深入研究。采用4因素3水平，通过Design Expert 8.0.6.1软件设计出试验组。研究发现盐酸用量、超声时间、水解温度和水解时间4个因素对氨基酸提取的影响都十分显著。最佳的浙贝母氨基酸提取条件为：6 mol/L盐酸8 mL、超声时间30 min、水解时间20 h及水解温度110 ℃。经过分析，这些因素间的交互作用，除了超声时间和水解温度的交互作用对其影响不显著外，其余交互作用对氨基酸提取的影响都十分显著。

表7 浙贝母鳞茎14种氨基酸独立样本t检验Table 7 T test of independent samples of 14 amino acids in bulbs of Fritillaria thunbergii Miq

采用柱前衍生法-UPLC测定8份浙贝母鳞茎栽前栽后样品中氨基酸含量，其中，精氨酸(Arg)含量最高，达到26.543 mg/g，其次是脯氨酸(Pro)，组氨酸(His)含量最低，仅有1.680 mg/g。栽前鳞茎总氨基酸含量为107.01～137.55 mg/g，栽后鳞茎总氨基酸含量为82.60～133.78 mg/g。总体来看，奉节和宁波浙贝母样品栽后的氨基酸含量比起栽前有所下降，奉节下降的最为明显，从137.55 mg/g下降至80.60 mg/g，而南通和磐安的浙贝母鳞茎中，栽后样品的氨基酸含量有所上升，南通从114.76 mg/g上升至121.89 mg/g，磐安则从107.01 mg/g上升至133.78 mg/g，结果表明从不同产地移植的鳞茎栽下后，环境对氨基酸含量还是存在一定的影响，导致这种差异的原因可能跟不同产地的生长环境、土壤条件等有关[22-23]。

本研究采用响应面法优化氨基酸提取条件后，建立了PITC柱前衍生化-UPLC法同时测定浙贝母鳞茎中14种氨基酸含量的方法，此方法灵敏度高、分离效果好、结果稳定可靠，可作为浙贝母的品质评价指标含量测定方法之一。采用此方法比较了不同产地浙贝母栽前栽后氨基酸含量差异，为浙贝母品种选育，解决其资源匮乏等问题提供了理论参考。