玫瑰红景天醇提物不同溶剂萃取物的生物活性

刘存芳 魏玲玲 王乙颖 吴 睿 田光辉

(1. 陕西理工大学化学与环境科学学院，陕西 汉中 723000；2. 陕西省催化基础与应用重点实验室，陕西 汉中 723000)

玫瑰红景天又名蔷薇红景天(RhodiolaroseaL.)[1]，是一种野生的红景天属草本植物，分布于中国西藏、甘肃以及芬兰、保加利亚等地[2]，全草可食用或药用[3]，是常用的珍稀中药材。研究表明，玫瑰红景天有抗辐射、抗自由基损伤、抗疲劳、调节免疫力等功效[4]，可用于治疗冠心病、中风偏瘫、胸痹心痛等病症，还能益气通脉、活血平喘[5]。玫瑰红景天中活性物质有红景天甙[6]、红景天素、络塞维等[7-8]，其深加工研究主要侧重于活性物质的分离鉴定[9-11]、测试醇提取物和挥发性物质的活性[12-14]，以及提取物的毒性和安全性[15]，并开发出了红景天酸奶、固体饮料等功能产品[16-17]。梁淑珍等[18]曾于80 ℃下用70%乙醇回流提取蔷薇红景天醇提物，并研究其乙酸乙酯相、正丁醇相和水相3种极性部位的抗氧化活性。通常情况下用乙醇水溶液提取出来的多是黄酮、多酚以及水溶性大分子蛋白质、多糖等化合物，还会有少量小分子极性物质，而无水乙醇提取物中蛋白质、多糖相对较少，其活性物质及提取物的生物活性可能存在差异。研究拟对玫瑰红景天无水乙醇提取物的环己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取物及水相物的活性成分含量及生物活性进行测试分析，以期为玫瑰红景天醇提取物的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

玫瑰红景天(RhodiolaroseaL.)：收集于西藏林芝地区，经陕西理工大学赵桦教授识别和确认，将其根茎低温干燥至恒重，粉碎过50目筛后密封保存；

金黄色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC25925)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis50040)、大肠杆菌(EscherichiacoliATCC25922)、肺炎链球菌(StreptococcuspneumoniaeATCC49619)、肺炎克雷伯氏菌株(KlebsiellapneumoniaeATCC 10031)、伤寒沙门氏菌(SalmonellatyphiCMCC50071)、鼠伤寒沙门菌(Salmonelltyphimurium50013)、短小芽孢杆菌(BacilluspumilusATCC7061)、白色念株菌(CandidaalbicansATCC10231)：中国食品药品检定研究院；

红景天甙、芦丁：纯度 ≥ 98.8%，中国食品药品检定研究院；

水解酪蛋白胨肉汤(MHB)、肉汤培养基(CM)、普通琼脂平板培养基：北京索莱宝科技有限公司；

无水乙醇、环己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、磷酸氢钠、磷酸、邻二氮菲、硫酸亚铁、双氧水溶液、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、维生素C、三氯乙酸、氯化铁等：分析纯，西安化学试剂厂；

试验用水为二次蒸馏水。

1.1.2 仪器

紫外可见光光度计：UV-6100型，上海精密仪器仪表有限公司；

生化培养箱：SPX-150B型，常州市伟嘉仪器制造有限公司；

电热鼓风干燥箱：101-0型，北京中兴伟业仪器有限公司；

电热恒温水浴锅：HH-2型，北京科伟永兴仪器有限公司；

电子天平：AL-204-IC型，北京瑞泽康科技有限公司；

旋转蒸发仪：EYELA型，上海巴玖实业有限公司；

微型植物粉碎机：FZ102型，北京格拉威尔科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 玫瑰红景天醇提物的制备 称量玫瑰红景天粉末60.0 g用滤纸筒包好，装进抽提筒，加无水乙醇至虹吸管口浸泡，圆底烧瓶中加总体积1/2的乙醇，80 ℃水浴下循环提取至抽提筒中乙醇呈无色(约回流24 h)，回收乙醇，得深褐色的玫瑰红景天乙醇提取物。重复提取10次，合并提取物，冷冻干燥至恒重。

1.2.2 不同溶剂萃取物和水相物的制备 将玫瑰红景天乙醇提取物按m乙醇提取物∶V水= 1∶100 (g/mL)分散于水中，摇匀，形成悬浊液，按V水溶液∶V环己烷= 9∶1先用环己烷萃取3次，合并萃取液后蒸馏回收环己烷，得到环己烷萃取物。同理，按V水溶液∶V有机溶剂= 9∶ 1依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，得到氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物。水相用旋转蒸发仪蒸干得到水相物。冷冻干燥后称重。

重复操作3次，合并各相应的萃取物和水相物，密封备用。

1.2.3 总酚和总黄酮含量的测定

(1) 总酚含量：参照文献[19]，以红景天甙为对照品，乙醇为溶剂。分别称取萃取物和水相物各200.00 mg 用乙醇溶解，定容于5个100 mL容量瓶中配成2.0 mg/mL溶液。

(2) 总黄酮含量：参照文献[1]，以芦丁为对照品，乙醇为溶剂。

1.2.4 体外抗氧化活性试验 现配现用溶液，1.5 mmol/L 邻二氮菲乙醇溶液、1.5 mmol/L硫酸亚铁水溶液、0.1 mmol/mL的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼乙醇溶液即DPPH溶液及质量分数0.02%过氧化氢溶液。pH 7.4摩尔浓度150 mmol/L PBS缓冲溶液：称取3.121 g 磷酸二氢钠用水溶解定容于100 mL容量瓶中，14.328 g磷酸氢钠定容于200 mL容量瓶中，分别吸量38.0 mL磷酸二氢钠溶液和162.0 mL磷酸氢钠溶液于300 mL容量瓶中定容。

(1) 清除DPPH·能力：根据文献[20]，修改如下：调配0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mg/mL系列质量浓度的萃取物、水相物、维生素C无水乙醇溶液，作为测试液。取36支 10 mL比色管，取1 mL不同质量浓度的测试液，每管加入2 mL DPPH溶液，无水乙醇定容混匀，避光室温放置30 min；以无水乙醇为空白，以无水乙醇代替DPPH溶液为对照，在517 nm下测定吸光度A。重复测量3次。按式(1)计算DPPH·清除率。

(1)

式中：

D——DPPH·清除率，%；

A0——空白试验吸光度；

A1——测试液吸光度；

A2——对照试验吸光度。

(2) 清除·OH能力：根据文献[13]，修改如下：取8支 10 mL比色管，均加入3.0 mL PBS溶液及1.0 mL邻二氮菲溶液摇匀，再加入2.0 mL硫酸亚铁溶液摇匀，分别吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL的2.0 mg/mL环己烷萃取物无水乙醇溶液加入编号为1～6号管中，作为测试液；另2支管标为损伤管和未损伤管，不加环己烷萃取物溶液，其中1～6号管和损伤管中再滴加1 mL过氧化氢溶液，未损伤管不加过氧化氢溶液。8支管中补水至刻度摇匀，置于生化培养箱内37 ℃下反应50 min后取出冷至室温，在510 nm下测定吸光度A。重复测量3次。同样，分别用氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水相物和维生素C溶液代替环己烷萃取物溶液。按式(2)计算·OH清除率。

(2)

式中：

H——·OH清除率，%；

A0——未损伤管吸光度；

A1——损伤管吸光度；

A2——加测试液吸光度。

(3) 还原能力：根据文献[18]，修改如下：配置环己烷萃取物1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mg/mL不同浓度的测试液。在6支10 mL离心管中加入3.0 mL PBS溶液、1.5 mL 0.01 g/mL铁氰化钾溶液摇匀后，依次加2 mL不同浓度的测试液，摇匀，50 ℃水浴下反应20 min，冷却至室温，再分别加入1 mL水和2.5 mL体积分数10%三氯乙酸溶液，摇匀后离心。在6支比色管中加入3 mL离心液、2 mL 0.1 g/mL氯化铁溶液以及1mL水，摇匀静置10 min，在700 nm下测定吸光度，重复测量3次。同样，分别用氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水相物和维生素C替代环己烷萃取物。

1.2.5 萃取物和水相物的抗菌试验 依据文献[20—21]，将萃取物和水相物分别溶于含质量分数5% Tween-80的肉汤中配成20.00 mg/mL的6种测试溶液，微量二倍稀释法测试最小抑菌浓度(MIC)，平面转种法测试最小杀菌浓度(MBC)。

1.3 数据处理

试验均重复3次，结果以平均值±标准误差表示，相关性分析用SPSS软件，绘图用OriginLab Origin V8.0软件。

2 结果与讨论

2.1 不同溶剂萃取物的提取率

如表1所示，不同溶剂萃取物间有显著性差异(P<0.05)，其中乙酸乙酯萃取物是氯仿萃取物的2倍，环己烷萃取物和水相物的提取率相当。玫瑰红景天乙醇提取物中乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和氯仿萃取物占总提取物重量的87.34%。

2.2 萃取物和水相物中总酚和总黄酮含量

由表2可知，不同溶剂萃取物和水相物中均含总酚和总黄酮，且二者在各萃取物中的含量存在显著性差异(P<0.05)，其中乙酸乙酯萃取物中总酚和总黄酮含量最高，分别为(469.32±1.15)，(338.57±0.92) mg/g萃取物。

2.3 萃取物和水相物的抗氧化活性

2.3.1 清除DPPH·的能力 由图1可知，不同溶剂萃取物和维生素C对DPPH·的清除作用均存在量效关系，当质量浓度为0.02～0.12 mg/mL时，随着萃取物质量浓度的增加，清除率也相应地增加，而维生素C清除DPPH·的能力相对最强。不同溶剂萃取物对DPPH·有明显的清除作用，与文献[22]报道的红景天提取物有较好的体外抗氧化作用有相似性。相同浓度下不同溶剂萃取物和水相物对DPPH·清除能力大小为：乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>氯仿萃取物>环己烷萃取物>水相物。

表1 玫瑰红景天乙醇提取物和不同溶剂萃取物的提取率†

图1 不同溶剂萃取物和水相物清除DPPH·的效果

2.3.2 清除·OH的能力 由图2可知，不同溶剂萃取物和水相物对H2O2/Fe2+体系经Fenton反应产生的·OH 有清除作用。不同溶剂萃取物、水相物和维生素C对·OH均表现出明显的清除效果，在0.02～0.12 mg/mL 的质量浓度范围内，清除能力呈量效关系，维生素C清除·OH的能力最强。不同溶剂萃取物和水相物清除·OH的能力存在差异，相同质量浓度下对·OH 清除能力大小为正丁醇萃取物>乙酸乙酯萃取物>氯仿萃取物和水相物>环己烷萃取物，与文献[18]报道的相同浓度下正丁醇相清除·OH的能力强于乙酸乙酯相的结果一致。

图2 不同溶剂萃取物和水相物清除·OH的效果

2.3.3 还原能力 由图3可知，不同溶剂萃取物、水相物和维生素C均有不同程度的还原能力，在试验质量浓度范围内，其抗氧化活性随质量浓度的增加而增大，呈较好的量效关系。维生素C还原能力最强，乙酸乙酯萃取物的还原能力明显高于其他萃取物，与文献[22—23]报道的红景天乙醇提取物有抗氧化作用的结果一致。

2.3.4 活性成分含量与氧化活性的相关性 通过Spearman分析不同溶剂萃取物和水相物的抗氧化活性(清除DPPH·、清除·OH、还原能力)与其活性成分(总酚和总黄酮)含量之间的相关性[24]，结果如表3所示。由表3可知，抗氧化活性与活性成分含量之间均存在显著的相关性(P<0.05)，此外，抗氧化活性之间表现出强相关性，说明抗氧化活性测定是可靠的；总酚和总黄酮含量之间也表现出相关性。

2.4 萃取物和水相物的抗菌效果

由表4可知，不同溶剂萃取物及水相物对试验菌株均有抑制和灭活作用。从MIC值来看，对9种细菌抑制作用强弱为氯仿萃取物>乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>环己烷萃取物>水相物，在9种细菌中对金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌均有较强的抑制作用，氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物的抑菌杀菌活性与文献[19]的结果一致。从MBC值来看，不同溶剂萃取物和水相物对试验菌株有不同程度的灭活作用，对金黄色葡萄球菌ATTCC25925株灭活作用更明显。

图3 不同溶剂萃取物和水相物的还原能力

表3 活性成分含量与氧化活性的Spearman相关系数†

表4 不同溶剂萃取物和水相物对试验菌株的MIC值和MBC值

3 结论

以无水乙醇为溶剂对玫瑰红景天进行回流提取，将醇提物溶于水并分别用环己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇进行萃取。经测定，乙酸乙酯萃取物中总酚和总黄酮含量最高；乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物的抗氧化活性更为明显；不同溶剂萃取物和水相物的抗氧化活性与其活性成分含量呈显著相关性(P<0.05)；不同溶剂萃取物和水相物对9种试验菌株均有抑制作用和灭活作用，对金黄色葡萄球菌和肠炎沙门氏菌的作用效果更好，氯仿萃取物和乙酸乙酯萃取物的抗菌活性较为显著。试验仅对玫瑰红景天醇提取物的不同溶剂萃取物和水相物的抗氧化和抗菌活性进行了初步测试，其萃取物和水相物中所含活性物质的种类和结构等还需要进一步研究。