超声波辅助糖基化对β-乳球蛋白消化过程中致敏性的影响

马秋平 王 辉 涂宗财,2,3 温平威 胡月明

(1. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西 南昌 330047；2. 江西师范大学国家淡水鱼加工技术研发专业中心，江西 南昌 330022；3. 江西师范大学江西省淡水鱼高值化利用工程技术研究中心，江西 南昌 330022)

食物过敏可引起免疫系统异常反应，当人体摄入食物过敏原后会引发一系列临床症状，包括皮肤、胃肠道和呼吸道[1]。据报道[2]，全球儿童和成人的食物过敏患病率分别约为7.5%和5.0%。牛奶是八大主要过敏原之一，牛奶过敏主要是IgE介导的I型超敏反应，主要是由牛奶中存在的β-乳球蛋白(β-lactoglobulin,β-Lg)引起的[3]。研究[4]表明，超声波辅助糖基化改性是一种较为有效的降敏方法。它利用超声波的热效应、机械剪切力、空化作用、声冲流等力的协同作用[5]，改变蛋白质的结构，使还原糖能在温和、短时间内对蛋白质进行专一性修饰，生成结构明确的蛋白质修饰产物，可以避免剧烈条件下的糖基化反应导致副产物众多以及产生对健康不利的产物，是一种新型的食品蛋白质糖基化修饰技术[6-7]。

课题组[8-9]利用超声波辅助糖基化技术先后将核糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖等连接到卵清蛋白(OVA)、β-Lg、乳白蛋白(α-La)等蛋白上，显著降低了被修饰蛋白的致敏性。毛积华等[10]研究了不同己糖(果糖、葡萄糖、半乳糖)对OVA的糖基化修饰效应，其中半乳糖修饰的OVA糖基化程度最高，其致敏性最低。Zhong等[11]研究表明超声波可以通过改变蛋白质结构进而显著提高糖化程度并增加牛血清蛋白的糖化位点，掩盖抗原表位从而降低其致敏性。Liu等[12]采用超声波辅助核糖糖基化修饰β-Lg，其致敏性下降了61.54%。然而，超声波辅助糖基化修饰的蛋白质进入人体后，需要经过胃和肠消化后才能被人体吸收，而蛋白质在整个消化过程中，胃蛋白酶和胰蛋白酶会通过酶切作用破坏其结构，可能会使消化产物的致敏性发生改变。

基于超声波辅助糖基化对β-Lg降敏的条件[12]，试验拟以β-Lg和乳糖(lactase)为原料，采用间接竞争ELISA法研究超声波结合糖基化修饰β-Lg在体外模拟消化过程中致敏性的变化，以水解度(DH)分析其消化特性，利用扫描电镜和动态光散射、荧光光谱等技术分析消化产物形态和结构的变化，以期科学评价超声波辅助糖基化修饰对蛋白质在消化过程中致敏性变化的影响，推动该技术在工业上的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

β-乳球蛋白(β-Lg)：> 90%，美国Aldrich-sigma公司；

α-乳糖(≥ 98%)、4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

胃蛋白酶(2 500 U/mg)、胰蛋白酶(250 U/mg)：北京索莱宝科技有限公司；

兔抗牛乳IgG一抗、羊抗兔IgG-HRP、羊抗人IgE-HRP：美国Biocheck Inc公司；

牛乳过敏患者IgE血清：美国Plasmalab International公司；

试验用水皆为蒸馏水；

其他试剂皆为国产分析纯。

1.1.2 过敏患者血清池 IgE血清池由4个牛乳过敏患者的血清(P1～P4)组成，其基本信息见表1。

1.1.3 主要仪器设备

超声波细胞破碎仪：JY92-ⅡN型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

粒度仪：Nano ZS90型，英国马尔文仪器有限公司；

表1 牛奶过敏患者信息

扫描电镜：Regulus 8100型，日本日立高新技术公司；

荧光分光光度计：F-7000型，日本日立高新技术公司。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 参照文献[12]。用超纯水溶解β-Lg样品成2 mg/mL，使用超声波细胞破碎仪以300 W处理15 min。以mβ-Lg∶m乳糖为1∶1混匀后冻干，相对湿度79%，55 ℃孵育4 h，冰浴终止，透析，冻干得糖基化样品，记作β-Lg-Lac-300，天然的β-Lg为对照品记作β-Lg-N。测得β-Lg-Lac-300样品的糖基化程度达52.14%。

1.2.2 模拟人体外胃肠消化 参照Minekus等[13]的方法稍作修改，将样品和胃蛋白酶添加到胃消化液(SGF)中，两者添加量分别为2 mg/mL和2 000 U/mL。调节溶液pH至3.0。在SGF中消化60 min后，使用模拟肠消化液(SIF)消化样品，样品和胰蛋白酶的添加量分别为1 mg/mL 和100 U/mL。分别在胃、肠消化0，15，30，60，90，120 min后取出1 mL，调节溶液pH至6.5以终止胃消化，添加4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟盐酸盐使终浓度为4 mmol/L 以终止肠消化。所有样品均于-20 ℃贮藏，并在一周内使用。样品β-Lg-N、β-Lg-Lac-300经SGF消化60 min分别记为β-Lg-N-G、β-Lg-Lac-300-G；再经SGF消化60 min分别记为β-Lg-N-GI、β-Lg-Lac-300-GI。

1.2.3 消化率测定 采用邻苯二甲醛(OPA)的方法[14]。以赖氨酸为标准品绘制标准曲线，样品质量浓度为1 mg/mL，于340 nm处测定吸光度。按式(1)计算消化率。

(1)

式中：

DH——消化率，%；

h——水解后每克蛋白质裂解的肽键数；

htot——每克蛋白质的肽键数；

A0——未消化样品的吸光度值；

A1——消化样品的吸光度值；

K——赖氨酸标准曲线的斜率；

MW——赖氨酸的分子量，g/mol；

b——样品质量浓度，mg/mL。

1.2.4 IgG/IgE结合能力测定 采用间接竞争ELISA评估所有样品的IgG/IgE结合能力，结合能力越低致敏性越低。96孔板用100 μL质量浓度为4 μg/mL的β-Lg溶液包被，37 ℃孵育1 h；加入250 μL质量分数为1%鱼明胶溶液封闭1 h；加入50 μL质量浓度为32 μg/mL待测样品，再加入50 μL IgG血清(VIgG∶V血清=1∶320 000)或者人血清(稀释至V人血清∶V水为1∶32)，孵育1 h；加入100 μL IgG-HR或IgE-HRP(VIgG∶VHRP=1∶5 000)二抗，孵育1 h；加入100 μL TMB染色液，孵育15 min，加入50 μL硫酸(2 mol/L)终止反应。于450 nm下测量样品吸光度。按式(2)计算IgG/IgE结合能力

(2)

式中：

B——IgG/IgE结合能力，%；

A——待测样品的吸光度值；

A0——用样品稀释液代替样品的吸光度值。

1.2.5 扫描电镜 轻铺一层样品于导电片上，喷金后置于扫描电镜下进行形貌表征。加速电压5 000 V，发射电流9.6 μA。

1.2.6 粒径测定 参照Pinto等[15]的方法，将消化后的样品稀释成0.25 mg/mL，采用马尔文激光粒度仪检测其粒径。样品于20 ℃平衡2 min，每个样品扫描3次取平均值。

1.2.7 电位分析 将消化后的样品稀释成0.25 mg/mL，散射角90°，平衡时间120 s，测试温度25 ℃，连续测试3次取平均值。

1.2.8 荧光光谱测定 使用荧光光谱仪测量样品的本征荧光强度，样品浓度为0.4 mg/mL。内源荧光：激发波长280 nm，扫描速度1 200 nm/min，扫描范围，300～420 nm。同步荧光：激发与发射波长间隔Δλ分别为15，60 nm，其他条件同同步荧光[10]。

1.2.9 统计学分析 所有试验均重复3次，结果以平均值+标准差表示，采用SPSS 23.0、Origin 9.0软件进行数据分析和制图。

2 结果与分析

2.1 超声波辅助糖基化对β-Lg消化率的影响

由图1可知，胃消化阶段，β-Lg-Lac-300的消化率低于β-Lg-N的，随着消化时间的延长，β-Lg-N的消化率增加较β-Lg-Lac-300快；胃消化60 min后，β-Lg-N的消化率仍增加，而β-Lg-Lac-300的消化率趋于稳定，表明超声波辅助糖基化显著降低了胃消化率。肠消化阶段，肠消化60 min后，β-Lg-N达到消化终点，消化率为68.81%，而β-Lg-Lac-300在60 min时的消化率为48.29%，120 min 时的达到59.85%，表明超声辅助糖基化减慢了β-Lg的肠消化速率。这可能是因为胃蛋白酶优先作用于苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)残基，而这些氨基酸残基不能被糖基化修饰[16]。但糖基化对赖氨酸(Lys)和精氨酸(Arg)残基的修饰，阻断了胰蛋白酶的作用位点[17]。同时，糖基化会降低酪蛋白、乳球蛋白、鳕鱼小清蛋白等蛋白的消化率[15,18]。

2.2 IgG/IgE结合能力

由图2可知，IgG/IgE结合能力随消化时间的延长而降低，且β-Lg-Lac-300的IgG/IgE结合能力显著低于β-Lg-N 的，二者在肠消化阶段降低较胃消化阶段的快；胃消化60 min后，β-Lg-N和β-Lg-Lac-300的IgG/IgE结合能力分别降为10.23%，8.31%；肠消化60 min后，β-Lg-N和β-Lg-Lac-300的IgG/IgE结合能力分别降为42.09%，32.09%，说明超声波辅助糖基化可有效降低β-Lg在消化过程中的致敏性。糖基化可通过掩盖或破坏蛋白质分子的过敏表位来降低其致敏性[19]，参与胃肠道消化的胃蛋白酶和胰蛋白酶则通过酶切作用破坏蛋白质的过敏表位，与文献[20]的结论相似。

2.3 扫描电镜

由图3可知，天然的β-Lg为平整的片状颗粒，有裂纹；经超声糖基化修饰后变得光滑而致密，裂纹消失，这可能是因为糖基化反应使蛋白表面被乳糖覆盖。而胃消化后，β-Lg-N表面出现大的孔洞，结构变得松散；经肠消化后进一步分解成颗粒和纤维絮状，但结构变得密集。而β-Lg-Lac-300经胃消化后形成的颗粒状结构大于β-Lg-N 的，表面未出现大的孔洞；经肠消化后表面出现孔洞，颗粒状结构仍大于β-Lg-N的，说明超声波辅助糖基化诱导的蛋白质聚集增加了β-Lg的胃肠消化抗性，与致敏性的降低有关，与Corzo-Martínez等[21]的结果相似。而糖基化过程中导致的构象破坏，可增加蛋白质的水解作用，这种明显的差异可能与蛋白种类和糖基化反应的程度有关[22]。

字母不同表示差异显著(P<0.05)

字母不同表示差异显著(P<0.05)

图3 β-Lg-N和β-Lg-Lac-300消化产物的扫描电镜图

2.4 粒径和ζ-电位

由表2可知，经超声糖基化处理后，β-Lg的平均直径从533 nm增加到578 nm，粒径分布系数增大，但其电位绝对值减小；证明超声糖基化处理改变了β-Lg的结构，降低了其分散性，这可能与糖基化导致的β-Lg结构的卷曲有关[15]。经胃肠消化后，β-Lg和β-Lg-Lac-300的直径均先减小后增大，β-Lg-Lac-300的胃消化产物粒子直径大于β-Lg-N的；肠消化后β-Lg-Lac-300粒子直径异常增大，PDI达到0.928；而β-Lg-Lac-300的电位绝对值均小于β-Lg-N的。综上，胃消化后的产物经肠消化后发生聚集，超声糖基化对蛋白水解作用的抑制使β-Lg-Lac-300以更大的粒径存在，分散性变差，可能是因为肠消化液的弱碱性环境，诱导这些带正电荷的碎片与周围带负电荷的环境发生非共价键聚合[23]。且糖基化增加了粒子之间的静电引力，蛋白质分子间静电引力的增加会减弱粒子间的疏水相互作用[24]，与扫描电镜的结果一致。因此，超声波辅助糖基化修饰最有可能是通过改变蛋白质聚集体的结构，而不是通过阻断酶促反应的切割位点来降低胃消化阶段β-Lg的消化率和致敏性[25]。同时，由超声波辅助糖基化修饰引起的空间位阻和静电相互作用的增加，可能不仅阻碍了蛋白质的聚集过程，而且还阻碍了胃蛋白酶和胰蛋白酶活性中心与消化底物之间的结合方式，从而影响机体对过敏位点的识别[26]。

表2 β-Lg-N和β-Lg-Lac-300消化产物的粒径分布和ζ-电位

2.5 荧光光谱

由图4可知，与β-Lg-N相比，β-Lg-Lac-300的荧光强度峰值降低，最大发射波长发生红移，从342 nm处移至366 nm处。胃肠消化后，荧光强度峰值呈先升高后降低的趋势，其中β-Lg-N肠消化后荧光强度峰值最低，且均出现红移，但红移程度不及β-Lg-Lac-300样品。这表明糖基化后β-Lg的Tyr残基所处微环境的亲水性增加，消化过程中β-Lg-N与β-Lg-Lac-300肽链的结构展开，内部的Trp残基逐渐暴露，消化产物的Tyr残基的疏水性增加，肽段的重新聚合又使Trp残基逐渐被掩埋[27]。说明β-Lg-Lac-300致敏性下降主要是因为乳糖对其线性表位的修饰，而随消化时间的延长，构象表位被破坏，其线性表位也不断减少，但在消化末期仍保持一定致敏性，说明小分子短肽的特殊序列依然会使机体对蛋白过敏。

图4 β-Lg-N和β-Lg-Lac-300消化产物的内源荧光光谱

同步荧光光谱中，Δλ为15 nm时表征的是酪氨酸的同步荧光光谱，Δλ为60 nm时则是色氨酸[28]。由图5可知，与β-Lg-N相比，糖基化后β-Lg-Lac-300的Tyr荧光强度均降低并伴有红移，Trp的荧光强度未明显改变。胃消化后，两者的Tyr和Trp荧光强度升高，并出现蓝移；肠消化后，两者的荧光强度降低并出现轻微的红移。说明消化过程中，Tyr和Trp微环境的疏水性先增强后逐渐减弱成亲水，并产生了从Tyr到Trp残基的能量转移[29]。这可能是因为消化过程中蛋白质结构被破坏，暴露了最初被非极性氨基酸包围的Tyr和Trp残基，使其环境从弱极性变成强极性，而消化后期小分子肽段的聚集又使得Tyr和Trp残基被掩蔽，其极性也随之减弱[30]。而且糖基化干预了胃蛋白酶和胰蛋白酶对β-Lg三级结构的破坏，与扫描电镜、粒径结果一致。说明糖基化对β-Lg 线性表位的修饰加上消化酶对其构象表位的破坏显著降低了β-Lg致敏性，也进一步说明了超声波结合糖基化是降低β-Lg致敏性较为有效的方法。

图5 β-Lg-N和β-Lg-Lac-300消化产物的同步荧光光谱

3 结论

试验表明，超声波结合糖基化处理对β-Lg肠胃消化性及消化过程中的致敏产生了显著影响。胃消化60 min后产物的IgG/IgE结合能力迅速降低，且在胃肠消化120 min 时最低，其胃肠消化的水解度也降低。被修饰的β-Lg经胃消化形成了更大的颗粒结构，并在肠消化后期发生聚集；其荧光强度呈先升高后降低的趋势并伴有红移。综上，超声波结合糖基化改性可有效降低β-Lg在消化过程中的致敏性，β-Lg致敏性的变化与超声波辅助糖基化修饰对其结构的改变有关。后续应利用蛋白质组学、质谱学、细胞学等技术，鉴别超声波辅助糖基化β-Lg的糖基化位点以及消化后的致敏肽段，以期实现该技术的工业化应用。