原发性免疫性血小板减少症患者血清微小RNA-155和微小RNA-146a表达情况及临床意义▲

孙桂芝 贺韦东 姬艳博 刘丽丽 竺 青 郭成山

(1 山东省血液中心机采成分科，济南市 250014，电子邮箱：sgz250014@163.com；2 山东第一医科大学第一附属医院血液内科， 济南市 250014；3 广东省深圳宝安区人民医院风湿免疫科，深圳市 518101)

原发性免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia，pITP)是一种临床上常见的获得性自身免疫性疾病，以血小板破坏过多、外周血血小板减少为特征，主要表现为广泛的皮肤黏膜出血，严重者可并发内脏出血、颅内出血，其发病机制目前仍未明确[1-2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度为21～25个核苷酸的非编码小分子RNA，广泛存在于真核生物中，是重要的基因表达调节因子，在各种生理过程中发挥重要的调控作用，并参与多种疾病的发生和发展过程，或可成为疾病诊断的潜在生物标志物。miRNA也是免疫系统发育和免疫应答过程中重要的调控因素之一，近年来，其在各种免疫性疾病中的作用逐渐被证实，对固有免疫和适应性免疫发挥重要的调控作用，其中miRNA-155、miRNA-146a在多种免疫性疾病中发挥重要作用[3]。相关研究表明，miRNA可能是参与pITP发病机制的重要调控分子，与pITP的病理生理发展过程密切相关[4-5]。目前关于miRNA-155、miRNA-146a在pITP中的作用鲜有研究报告。本研究分析pITP患者miRNA-155、miRNA-146a表达水平及其临床意义，以期为pITP的临床诊断提供一定参考依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年11月至2019年11月于山东第一医科大学第一附属医院就诊的130例pITP患者作为观察组，纳入标准：(1)符合pITP的诊断标准[6]；(2)患者及其家属知情同意，并签署同意书；(3)临床资料完整者。排除标准：(1)肝、肾、甲状腺功能异常患者；(2)合并严重心脑血管疾病患者；(3)合并恶性肿瘤患者；(4)合并其他免疫性、代谢性疾病患者。选取同期于山东省血液中心的130例机采血小板捐献者作为对照组。其中，观察组男性68例、女性62例，年龄18～52(30.52±10.11)岁；对照组男性64例、女性66例，年龄19～50(31.26±9.85)岁。两组研究对象的性别、年龄差异无统计学意义(均P>0.05)。

1.2 主要试剂与仪器 PowerUP SYBR Master Mix(货号：A25742)购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；TRIzol RNA提取试剂盒(货号：15596-026)购自美国Invitrogen公司；Allegra X-15R低温高速离心机购自美国贝克曼库尔特公司；反转录试剂盒(货号：ALH266-PTO)购自北京百奥莱博科技有限公司；NanoDrop微量分光光度计、Applied Biosystems 实时荧光定量RT-PCR仪均购自购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Sysmex-XN 2000全自动血液分析仪购自日本Sysmex公司；miRNA-155、miRNA-146a、U6引物由EXIQON公司合成。

1.3 血小板相关参数指标的检测 采集所有研究对象空腹血液样本5 mL，采用Sysmex-XN 2000全自动血液分析仪检测血小板计数、血小板平均体积(mean platelet volume，MPV)、血小板分布宽度(platelet distribution width，PDW)。

1.4 血清miRNA-155、miRNA-146a表达水平的检测 采集所有研究对象空腹静脉血5 mL，2 500 r/min离心10 min后取上层血清，-80℃冰箱储存备用。按照RNA提取试剂盒说明书提取血清总RNA，紫外分光光度计检测及鉴定RNA浓度及纯度，按照反转录试剂盒说明书将血清RNA反转录成cDNA，而后取反转录产物进行实时荧光定量PCR，以U6为内参基因。miRNA-155上游引物为5′-ACCCTGCTGGATGAACGTAG-3′，下游引物为5′-CATGTGGGCTTGAAGTTGAG-3′；miRNA-146a上游引物为5′-CACGGACCTGAAGAACACTGG-3′，下游引物为5′-AGAAATGAAATTAGAACACACATCAATCC-3′；U6上游引物为5′-ATCCGCAAAGACCTGT-3′，下游引物为5′-GGGTGTAACACTAAG-3′。实时荧光定量PCR反应体系共20 μL：PowerUP SYBR Master Mix 10 μL，cDNA 4.0 μL，上下游引物(10 μM)各1 μL，ddH2O 4.0 μL。反应条件：92℃ 60 s；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环。每个标本设置3个复孔，反应结束收集数据，以2-ΔΔCT法计算血清中miRNA-155、miRNA-146a相对表达量。

1.5 统计学分析 采用SPSS 22.0进行数据分析。符合正态分布的计量资料以(x±s)表示，组间比较采用t检验或t′检验；计数资料以例数(百分比)表示，比较采用χ2检验；相关性分析采用Pearson检验；采用Logistic回归模型分析影响pITP发生的因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组血小板相关参数的比较 观察组血小板计数低于对照组，PDW及MPV水平高于对照组(均P<0.05)，见表1。

表1 两组血小板相关参数的比较(x±s)

2.2 两组血清miRNA-155、miRNA-146a表达水平的比较 观察组血清miRNA-155相对表达水平高于对照组，而血清miRNA-146a相对表达水平低于对照组(均P<0.05)，见表2。

表2 两组血清miRNA-155和miRNA-146a相对表达水平的比较(x±s)

2.3 pITP患者血清miRNA-155、miRNA-146a表达水平与血小板参数指标的相关性 pITP患者血清miRNA-155相对表达水平与血小板计数呈负相关，与PDW、MPV均呈正相关(均P<0.05)；血清miRNA-146a相对表达水平与血小板计数呈正相关，与PDW、MPV均呈负相关(均P<0.05)。见表3。

表3 pITP患者血清miRNA-155、miRNA-146a相对表达水平与血小板参数指标的相关性

2.4 pITP发生的影响因素的Logistic回归分析 以所有研究对象的血清miRNA-155、miRNA-146a水平均值为界限分为高表达和低表达。将血清miRNA-155、miRNA-146a纳入自变量(miRNA-155赋值：高表达=1，低表达=0；miRNA-146a赋值：低表达=1，高表达=0)，以是否发生pITP为因变量(是=1，否=0)，进行Logistic回归分析。结果显示，血清miRNA-155高表达、血清miRNA-146a低表达均是影响pITP发生的独立危险因素(均P<0.05)，见表4。

3 讨 论

pITP是一种常见的以血小板破坏过多为特征的自身免疫性疾病，其临床表现主要为皮肤黏膜或内脏出血，严重影响患者健康。pITP的发病机制尚不十分明确，传统观点认为主要是由体液免疫异常所致：B淋巴细胞产生大量针对自身血小板的抗体，导致血小板异常，包括血小板破坏增加和生成减少两方面[7-8]。血小板计数是反映机体中血小板生成、衰老情况的重要指标，其水平下降是引起出血的主要原因。PDW是反映患者血小板体积异质性的主要指标，其水平升高则表示血小板体积呈均一性下降。MPV是反映血小板体积大小的指标，与血小板密切相关[9]。本研究结果显示，与对照组比较，pITP患者血小板计数水平降低，PDW及MPV水平均升高，表明pITP患者血小板遭到破坏，导致血小板相关参数指标异常。

miRNA是一类内源性非编码小分子RNA，其通过碱基互补配对的方式结合到靶基因上，导致靶基因降解或者抑制其翻译，影响正常细胞的分化和生长过程，在人类免疫细胞成熟分化、发育、凋亡中起重要作用，其异常表达可导致机体免疫功能异常，甚至引起多种自身免疫疾病及其他多种疾病[3]，已成为分子医学领域的研究热点。miRNA可能是参与pITP发病机制的重要调控分子。研究显示，pITP患者的T淋巴细胞、单个核细胞及血浆中存在多种miRNA的异常表达[10-11]。Th1/Th2的平衡调节着机体免疫系统的稳定，而在多种自身免疫性疾病中该平衡被破坏，其在pITP的发病机制中也发挥重要作用，Th1/Th2平衡失调介导B淋巴细胞产生抗血小板抗体，进而引起血小板被破坏[12]。相关研究表明，miRNA-155、miRNA-146a可能影响Thl/Th2平衡并在疾病进展中发挥重要作用[13-14]。

研究表明，miRNA-155与多种自身免疫性疾病的发生、发展密切相关，其过表达能够过度激活自身反应性B细胞产生大量特异性抗体，导致机体免疫系统亢进，介导疾病的发生[15]。呼小茹等[3]的研究表明，pITP患者miRNA-155表达水平高于健康对照组，其过度表达可能通过体液免疫参与pITP的发生，并与疾病分期、预后、病情严重程度有关。郭莹等[16]研究发现，pITP患者B淋巴细胞中miRNA-155表达水平增高。本研究结果显示，观察组血清miRNA-155水平高于对照组，与以上研究结果相似，这提示miRNA-155可能参与pITP的发生，其对疾病诊断具有一定的价值。相关性分析结果显示，pITP患者miRNA-155相对表达水平与血小板计数呈负相关，与PDW、MPV均呈正相关(P<0.05)，表明pITP患者血清miRNA-155表达水平可影响血小板生成、衰老及体积异质性和大小，进而影响疾病。本研究进一步Logistic回归分析结果显示，血清miRNA-155高表达是影响pITP发生的独立危险因素，表明血清miRNA-155可能参与pITP的发生，其水平升高提示存在发生pITP的风险。

miRNA-146a是miRNA-146家族中的一员，广泛参与人体免疫细胞分化、自身免疫性疾病、肿瘤等发生和发展，并主要在免疫调控中发挥作用，在多种自身免疫性疾病中存在异常表达[13]。郑雪倩等[17]的研究表明，与正常人相比，pITP患者外周血单个核细胞中miRNA-146a表达显著降低，且与pITP患者外周血中血小板数量呈正相关。本研究结果显示，观察组血清miRNA-146a相对表达水平低于对照组(P<0.05)，提示血清miRNA-146a可能也在pITP的发生中发挥重要作用，其水平降低预示pITP的发生，与佟丹江等[13]研究结果相似。相关性分析结果显示，miRNA-146a相对表达水平与血小板计数呈正相关，与PDW、MPV均呈负相关(P<0.05)，表明pITP患者血清miRNA-146a水平可能通过影响血小板的数量、体积，进而加重疾病。本研究Logistic回归分析结果显示，血清miRNA-146a低表达是影响pITP发生的独立危险因素，提示miRNA-146a低表达可能与pITP的发生存在一定联系，但其具体作用机制仍需进一步研究。

综上所述，pITP患者血清miRNA-155表达水平升高，血清miRNA-146a表达水平下降，两者或共同参与了pITP的发生机制，这为进一步研究miRNA在pITP中的作用提供新的线索。但因本研究的样本数量有限，相关结果仍需进一步扩大样本量进行研究验证，并深入探讨血清miNAR-155、miRNA-146a在pITP中的具体作用机制。