粒细胞集落刺激因子治疗脊髓损伤的作用机制及临床研究进展▲

唐 云 许建文

(1 广西中医药大学第一临床医学院，南宁市 530001，电子邮箱：392052833@qq.com；2 广西医科大学第一附属医院康复医学科，南宁市 530021)

【提要】 脊髓损伤具有很高的发病率和致残率，可引起严重的神经损伤，目前尚无有效的方法使其功能完全恢复。在动物模型和临床试验中，已经观察到粒细胞集落刺激因子对脊髓损伤具有神经保护作用。本文针对粒细胞集落刺激因子治疗脊髓损伤的作用机制研究及临床应用研究进行综述，以期为脊髓损伤的治疗提供新的思路，从而更好地改善脊髓损伤患者的预后。

脊髓损伤是由外力直接或间接作用于脊髓而导致的损伤，是一种常见的可导致永久性残疾的中枢神经系统创伤性疾病，伴有感觉和运动功能丧失、自主神经功能紊乱[1-2]。脊髓损伤分为原发性和继发性损伤两个阶段，其中原发性脊髓损伤是由机械创伤引起的，病理生理学变化包括轴突、血管和细胞膜的破坏等。继发性损伤是原发性机械损伤之后的阶段，是一种细胞和分子级联反应，可引起水肿、缺血、兴奋性毒性、自由基产生、炎症和凋亡等[3-4]。研究表明，脊髓修复过程中所面临的主要障碍是继发性损伤，通过适当的外源性干预可以减少继发性损伤，改善神经功能，促进脊髓损伤患者的恢复[5]。由于对神经功能障碍疾病治疗及康复需求的日益增加，临床上需要更为有效的脊髓修复和再生疗法，以提高患者的生活质量。

研究表明，造血生长因子如促红细胞生成素、血小板生成素、各种集落刺激因子等在血液祖细胞的生长、存活、分化中发挥重要作用，部分细胞因子已被证实能够影响神经干细胞和祖细胞的增殖，且大多数在大脑中有特定的受体[6]。粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)是一种低分子糖蛋白，主要由内皮细胞、骨髓基质成纤维细胞以及免疫活性细胞产生[7]。G-CSF受体属于Ⅰ型细胞因子受体超家族，在许多脑区广泛表达，如海马、脑室下区、小脑等。G-CSF可作为中枢神经系统的内源性配体，与G-CSF受体结合后被激活，从而发挥多种生物学作用[8-9]。G-CSF在临床上被广泛用于治疗中性粒细胞减少症，以及动员外周血来源的造血干细胞以用于移植，随着对G-CSF作用机制研究的不断深入，越来越多的学者发现G-CSF除了造血功能以外，还具有神经保护和促进神经细胞再生功能，是重要的神经营养因子。例如，G-CSF在脑卒中、肌萎缩性侧索硬化、阿尔兹海默病、创伤性脑损伤等神经损伤性疾病中发挥重要作用[10-13]。也有越来越多的学者研究G-CSF对脊髓损伤的影响，故本文就G-CSF在脊髓损伤中的作用机制及临床研究做一综述。

1 G-CSF治疗脊髓损伤的作用机制

1.1 抗凋亡作用及促进自噬 G-CSF在中枢神经系统中具有双重活性，不仅能增加脑缺血后的长期可塑性，有利于减轻急性神经元变性，还可抑制内质网和线粒体应激从而对受损神经元起到保护作用，并通过减少促凋亡蛋白和增加抗凋亡蛋白来维持细胞稳态[14]。研究表明，给予G-CSF治疗慢性脊髓压迫大鼠8周后能显著减少凋亡细胞的数量，保护前角运动神经元[15]；小鼠脊髓横断损伤后，给予G-CSF治疗可以上调抗凋亡G-CSF靶基因B细胞淋巴瘤-XL(B-cell lymphoma-extra large,Bcl-XL)的表达，此外，G-CSF在大鼠分离的海马神经元中具有神经营养特性，可以增强海马神经元的神经突生长能力[16]。这提示G-CSF作为神经生长因子，通过抗细胞凋亡而发挥保护神经元的作用。还有学者在小鼠脊髓半切损伤模型中发现，G-CSF受体和抗凋亡蛋白核仁磷酸蛋白1在脊髓神经元上均有表达，G-CSF的神经保护机制可能与核仁磷酸蛋白1抑制神经元凋亡有关[17]。G-CSF受体在少突胶质细胞中也有表达，Kadota等[18]研究G-CSF对脊髓损伤后大鼠少突胶质细胞的作用，发现G-CSF上调能促进抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达，减少少突胶质细胞凋亡，且促进大鼠后肢功能的恢复。 此外，细胞自噬是机体重要的防御和保护机制，在脊髓损伤后的细胞修复中发挥重要作用，脊髓损伤后细胞自噬水平的升高可减轻神经元损伤[19]。研究显示，G-CSF可以诱导损伤脊髓中自噬的激活，通过抑制核因子κB信号通路和保护脊髓损伤后神经元结构，促进自噬并减少神经元凋亡[20]。

1.2 抑制炎症反应 炎症反应是继发性脊髓损伤的主要机制之一，脊髓损伤后炎症相关基因表达上调，导致进一步的组织损伤，因此有效控制损伤后的过度炎症反应，可以减少脊髓损伤后的继发性病变。研究表明，G-CSF可以减轻大鼠缺氧缺血后神经炎症反应并稳定血脑屏障[21]。有学者建立了小鼠脊髓半切模型，发现G-CSF能在脊髓损伤后72 h内将小胶质细胞招募到损伤部位；此外，G-CSF在BV2小胶质细胞中能够抑制炎症介质肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、诱导型一氧化氮合酶、白细胞介素1β(interleukin 1β,IL-1β)的表达，增加M2巨噬细胞表型标记物并降低M1巨噬细胞标志物的表达，有利于小胶质细胞在脊髓半切微环境下的M2极化；G-CSF还可诱导小胶质细胞的选择性激活，并通过阻断核因子κB信号通路，减少早期炎症所致的有害影响，促进有利于修复的抗炎反应[22]。有学者发现50 μg的G-CSF可以降低脊髓挫伤大鼠中脂质过氧化产物丙二醛浓度和髓过氧化物酶活性，保护脊髓免受损伤后中性粒细胞的浸润[23]。

1.3 促进干细胞动员 G-CSF是一种常用的干细胞动员剂，被广泛应用于动员造血干细胞从骨髓释放到外周血中。在稳态条件下，造血干细胞通过趋化因子CXCL12/基质细胞衍生因子1和趋化因子受体CXCR4的相互作用保留在骨髓中；G-CSF可以激活骨髓中的中性粒细胞，释放组织蛋白酶G、中性粒细胞弹性蛋白酶和基质金属蛋白酶9等蛋白水解酶，来破坏CXCL12和CXCR4之间的相互作用，使得造血干细胞从骨髓释放到外周血[24]。有学者发现，G-CSF动员是一种成功富集大鼠外周血间充质干细胞(peripheral blood-derived mesenchymal stem cell，PBMSC)的方法，同时可用于维持细胞移植的MSC表型；而将经G-CSF动员获得的PBMSC植入脊髓损伤大鼠体内后，大鼠的运动功能得到改善[25]。Takahashi等[26]的研究表明，脊髓内移植G-CSF动员的CD34+细胞或单个核细胞可促进血管生成、抑制少突胶质细胞凋亡和脱髓鞘。还有学者发现，G-CSF与造血细胞因子FMS样酪氨酸激酶3配体协同作用，动员造血祖细胞进入外周血，可增加血液中可用骨髓干细胞的数量，这两种因子的结合可进一步延长骨髓细胞的动员作用[27]。

1.4 促进血管生成 局部血管和血脑屏障受损会导致炎症和缺血，从而造成脊髓神经组织的整体损伤，受损神经组织的自我修复能力有限，因此，减少血管损失和恢复血管功能，以及促进新血管的形成，有助于脊髓损伤后的功能恢复[28]。有研究显示，大鼠实验性脊髓压迫损伤后，给予G-CSF和平板运动等治疗可以增加损伤脊髓血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表达，促进血管生成[29]。在大鼠脊髓缺血模型中，G-CSF也可上调损伤后VEGF-A的表达[30]。有学者使用G-CSF治疗脊髓挫伤后的大鼠，发现直径大于20 mm的血管总数增多，VEGF、肝细胞生长因子和成纤维细胞生长因子2表达水平增高，提示脊髓损伤后G-CSF通过促进血管生成发挥神经保护作用，即血管生成有助于神经组织的再生反应[31]。

1.5 促进神经修复 已有研究表明，给予G-CSF治疗坐骨神经横断小鼠，可以提高神经修复潜力，改善神经再生[32]。Pang等[33]发现，G-CSF可以促进体外培养的牙源性神经干细胞的增殖及其脑源性神经营养因子、胶质细胞源性神经营养因子和神经生长因子的分泌，利用G-CSF和牙源性神经干细胞移植联合治疗脊髓挫伤大鼠，大鼠的行为障碍有所改善。轴突的生长被认为是神经再生和修复的一个关键过程，而G-CSF有利于受损轴突的修复。例如，有学者发现，在大鼠脊髓挫伤后给予G-CSF治疗，可以下调转化生长因子β1的表达，降低Ras同源基因(Ras homolog gene,Rho)/Rho相关螺旋卷曲蛋白激酶的活性，从而形成有利于轴突生长的环境[34]；早期给予脊髓损伤大鼠G-CSF治疗可抑制硫酸软骨素蛋白多糖的表达，保护轴突纤维免受破坏性损伤，对轴突再生和功能恢复具有有益作用[35]；Lee 等[36]的研究也显示，给予G-CSF治疗脊髓损伤大鼠，可以明显减少轴突的断裂、脱髓鞘，且促进轴突发芽和再生。

1.6 抗兴奋性毒性 兴奋性氨基酸(excitatory amino acid,EAA)的释放也是脊髓损伤后重要的继发性损伤因素，EAA过度激活谷氨酸受体可导致自由基产生、继发性兴奋毒性、线粒体通透性转运激活等不良后果[37]。已有研究表明，G-CSF干预可以抑制缺血性脑卒中后的兴奋性毒性[38]。Chen等[39]研究发现，对脊髓缺血大鼠予注射G-CSF，可抑制EAA的释放，并调节脊髓内谷氨酸转运体的表达，发挥抗兴奋性毒性作用。

1.7 镇痛 研究表明，在慢性压迫性损伤大鼠模型中，给予G-CSF干预可缓解神经性疼痛的机制与激活白细胞源性内源性阿片类物质分泌、下调IL-6和TNF-α的表达有关[40]。Kato等[41]发现在大鼠脊髓挫伤3周后给予连续5 d腹腔注射重组人G-CSF，可以抑制小胶质细胞活化，降低p38丝裂原活化蛋白激酶和IL-1β的表达，从而减轻挫伤所致机械性痛觉超敏。也有研究表明，G-CSF可减轻大鼠脊髓损伤后的热痛觉过敏和冷触诱发痛[42]。以上研究结果提示，G-CSF可治疗脊髓损伤引起的神经性疼痛，从而有助于脊髓损伤患者的病情恢复。

2 G-CSF治疗脊髓损伤的临床研究

目前，有关G-CSF的应用，已在众多领域中开展了一系列相关的临床试验，大部分研究结果显示G-CSF的疗效肯定且并发症少。近年来，许多学者也将其应用于脊髓损伤的治疗中，探讨其安全与有效性。

2.1 脊髓损伤急性期 Derakhshanrad等[43]报告了1例应用G-CSF和MSCs联合治疗急性脊髓损伤的病例，患者治疗后神经功能得到改善，因此认为该方案可作为常规康复方案的辅助治疗。Takahashi等[44]进行了一项Ⅰ/Ⅱa临床试验，纳入16例发病48 h以内的脊髓损伤患者，其中5例患者给予连续5 d静脉注射[5 μg/(kg·d)]G-CSF，另外11例患者给予10 μg/(kg·d)G-CSF；结果显示，10 μg组的美国脊髓损伤协会(American Spinal Injury Association,ASIA)运动和感觉评分显著提高，其中2例患者出现尿路感染，经抗生素治疗后痊愈，1例患者出现轻度肝功能障碍，可自行缓解，未发生其他严重不良事件。随后进行的多中心、前瞻性、非随机对照临床试验结果显示，连续5 d静脉注射10 μg/(kg·d) G-CSF治疗的患者治疗后1周及1年的ASIA运动评分均优于未使用G-CSF治疗的患者，进一步证实G-CSF对急性脊髓损伤具有神经保护作用[45]。此外，Kamiya等[46]比较接受G-CSF与接受甲泼尼龙琥珀酸钠治疗的急性脊髓损伤患者的临床效果和药物相关不良事件，发现后者的肺炎发病率(44.1%)明显高于前者(3.6%)，而前者在促进神经恢复方面具有更好的效果。综上所述， G-CSF治疗急性脊髓损伤具有较好的疗效和安全性。

2.2 脊髓损伤慢性期 一项开放性Ⅰ期研究纳入19例慢性运动性脊髓损伤患者，给予皮下注射5 μg G-CSF，治疗5 d，并随访至少6个月，结果表明治疗后患者ASIA、国际神经修复学会脊髓损伤功能评价量表(International Association of Neurorestoratology Spinal Cord Injury Functional Rating Scale,IANR-SCIFRS)和脊髓独立性评定量表Ⅲ(Spinal Cord Independence Measure Ⅲ,SCIMⅢ)评分均比治疗前提高，在改善膀胱和肠道功能方面也效果显著[47]。一项Ⅲ期临床试验纳入了120例不完全慢性创伤性脊髓损伤患者，其中G-CSF组连续7 d皮下注射300 μg的G-CSF，而安慰剂组注射生理盐水，结果显示G-CSF组ASIA运动评分高于安慰剂组，G-CSF组中仅有少数患者出现一过性的骨痛、肌肉疼痛、头痛、恶心、呕吐等并发症[48]。由此可见，对于慢性脊髓损伤的患者，G-CSF有助于其运动、感觉功能障碍的恢复。

2.3 脊髓损伤亚急性期 Derakhshanrad等[49]纳入亚急性期不完全创伤性脊髓损伤患者，进行了一项Ⅱ/Ⅲ期前瞻性、安慰剂对照、双盲、平行随机临床试验，其中治疗组每天皮下注射300 μg G-CSF，连续7 d，对照组给予安慰剂；随访6个月后，对照组的ASIA损伤分级保持不变，G-CSF组的ASIA损伤分级有不同程度提高，且G-CSF组脊髓损伤神经学分类国际标准运动评分、IANR-SCIFRS和SCIMⅢ评分均优于对照组。这提示，G-CSF可减轻亚急性期不完全创伤性脊髓损伤患者的神经损伤，改善其相关功能。

3 小结与展望

通过对不同脊髓损伤模型进行研究发现，G-CSF可通过抗凋亡、抗炎症、促进干细胞动员、促血管生成、促神经发生、抗兴奋性毒性及镇痛等机制发挥治疗脊髓损伤的作用，这些基础研究为G-CSF的应用提供了相关依据。目前进行的临床试验也表明G-CSF治疗脊髓损伤是可行的，G-CSF可促进急性、慢性、亚急性期脊髓损伤患者的功能恢复，为G-CSF临床应用的安全性提供了一定的佐证。但是，目前仍有一些问题需要解决，如损伤后治疗的时机、G-CSF给药最佳剂量、用药途径、疗程等，同时还应结合患者的年龄、损伤程度、发病时间长短、药物耐受等因素制定全面康复的策略，才能更规范、安全的运用G-CSF。未来也需要开展更多大样本、多中心的随机对照试验，进一步推进G-CSF的临床运用，优化脊髓损伤患者的康复方案。以上基础研究及临床试验研究结果均表明，G-CSF具有修复神经损伤和神经保护的作用，是治疗中枢神经系统疾病的候选因子，具有广阔的临床应用前景。