宫颈癌患者血清长链非编码RNA-核富集转录体1的表达情况及临床意义▲

刘 瑞 孟焕然 张 莉 马亚楠 宋琳琳 张雪玉

(1 宁夏医科大学总医院心脑血管病医院妇科，银川市 750002，电子邮箱：hojj4752@163.com;2 宁夏回族自治区中医医院妇产科，银川市 750002;3 宁夏医科大学总医院妇科，银川市 750004)

宫颈癌作为女性最常见的生殖系统恶性肿瘤之一，具有较高的发病率，且该病在早期具有较强的隐匿性，患者普遍无典型临床表现，这导致大部分患者确诊时已处于中晚期，错过了手术根治的时机，预后不理想[1]。因此，早期有效的诊断对于提高宫颈癌临床治疗效果以及改善患者预后显得尤为重要。目前，临床上尚无高效且特异的肿瘤标志物，这使得宫颈癌患者的早期诊断以及治疗后随访难度加大[2]。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)核富集转录体1(nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1)是组成细胞核内核旁斑的重要部分之一，其介导核旁斑核心结构的构成，且参与了一系列基因转录的调节[3-4]。有研究报告，lncRNA-NEAT1在食管鳞状细胞癌、肝癌、胶质瘤以及结直肠癌等多种肿瘤疾病的发生、发展过程中发挥着极其重要的作用[5-6]。然而，关于其在宫颈癌患者中表达水平的相关研究并不多见。因此，本研究检测宫颈癌患者血清lncRNA-NEAT1的表达并分析其临床意义，旨在为临床宫颈癌的早期诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料 纳入2015年6月至2018年12月宁夏医科大学总医院心脑血管病医院妇科收治的120例宫颈病变患者为研究对象。其中宫颈癌患者52例(宫颈癌组)，年龄23～70(44.69±9.56)岁；宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)患者68例(CIN组)，包括CIN Ⅰ级42例，CIN Ⅱ～Ⅲ级26例，年龄22～68(45.23±10.35)岁。纳入标准：(1)所有研究对象均经手术病理组织活检确诊为宫颈癌或CIN；(2)入院前均未接受放疗、化疗等相关抗肿瘤治疗；(3)既往无肿瘤病史，且近期无输血史；(4)均拟行手术治疗；(5)临床病历资料无缺失；(6)患者或其家属已知情同意，并签署同意书。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤者；(2)心、肝、肾等重要脏器存在病变者；(3)无法正常交流沟通或伴有神经系统疾病者；(4)正参与其他研究者。另选择同期于我院进行体检的50例健康女性作为对照组，年龄21～69(45.19±10.06)岁。3组研究对象的年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本次研究已得到医院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法 采集所有研究对象的清晨空腹静脉血5 mL，4℃ 下以16 000 r/min离心10 min，吸取上清液装入EP管内，保存在-80℃冰箱中备用。采用RNA提取试剂盒(miRNeasy Serum/Plasma Kit，德国QIAGEN公司，批号：20141201)提取血清总RNA。按照反转录试剂盒(Prime-ScriptTMRT reagent Kit，日本Takara公司，批号：20150315)说明书进行反转录操作，获取cDNA，反应条件为37℃ 15 min、85℃ 5 s。以双蒸水为空白对照，以cDNA为模板，采用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)试剂盒[天根生化科技(北京)有限公司，批号：20150406]、美国ABI 7500 FAST实时定量PCR仪进行定量PCR反应。NEAT1上游引物为5′-TGGCTAGCTCAGGGCT-3′，NEAT1下游引物为5′-TCTCCTTGCCAAGCTTCCTTC-3′；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)上游引物为5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，GAPDH下游引物为5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。PCR反应体系为20 μL，包括cDNA模板1 μL、上游和下游引物各1 μL、Taq Mix 10 μL及无RNA酶水7 μL。反应条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 min,58℃ 30 s，72℃ 30 s，共40个循环。待上述反应结束后通过配套的计算机软件读取各反应管内的Ct值。血清lncRNA-NEAT1的相对表达水平采用2-△△Ct法计算。

1.3 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行数据分析。计量资料以(x±s)表示，两组间比较采用t或t′检验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q法；计数资料以例数或百分比表示。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组血清lncRNA-NEAT1相对表达水平对比 宫颈癌组及CIN组患者血清lncRNA-NEAT1的相对表达水平高于对照组；宫颈癌组患者血清lncRNA-NEAT1的相对表达水平高于CIN组(P<0.05)。见表1。

表1 3组血清lncRNA-NEAT1相对表达水平对比(x±s)

2.2 宫颈癌组患者血清lncRNA-NEAT1相对表达水平与临床病理特征的关系 低分化患者的血清lncRNA-NEAT1相对表达水平高于中高分化患者(P<0.05)；其他不同临床病理特征患者之间血清lncRNA-NEAT1相对表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 宫颈癌组血清lncRNA-NEAT1相对表达水平与临床病理特征的关系(x±s)

3 讨 论

由于lncRNA不具备编码蛋白质的能力，早期并未引起人们的关注[7]。近年来，随着基因研究的逐渐深入，有学者发现基因翻译成蛋白质的过程可能有多种调控序列参与，而lncRNA在多种生物学活动中均起着至关重要的作用[8-10]，主要包括以下几点：(1)抑制RNA聚合酶Ⅱ活性或参与染色质重构、组蛋白修饰，继而对下游基因表达进行调节；(2)通过对蛋白编码基因上游启动子区转录的调节，继而影响该基因的表达水平；(3)与蛋白编码基因的转录本形成互补双链，继而影响mRNA剪切，形成不同剪切形式，进一步导致该基因的表达异常等。研究显示，lncRNA在肝癌[11]、结肠癌[12]以及乳腺癌[13]等组织中存在异常表达，且与肿瘤表型及患者预后有着密切关系。这提示lncRNA或可成为部分肿瘤疾病潜在的分子标志物以及治疗靶点，这为肿瘤的早期诊断以及早期治疗提供了新的思路。

lncRNA-NEAT1是核旁斑重要结构的组成部分，近年来有学者发现，多种恶性肿瘤(如胃癌[14]、非小细胞肺癌[15])组织中存在lncRNA-NEAT1表达异常上调的现象。此外，有体外细胞实验证实，lncRNA-NEAT1可以通过靶向上调下游癌基因(如CBX7、RTCB)的表达，促进肿瘤细胞的恶性生长和迁移[16]。此外，在三阴性乳腺癌细胞中lncRNA-NEAT1的表达上调能够促进细胞干性标志物(如SOX4等)的表达，诱导肿瘤细胞发生上皮-间质转化，使肿瘤细胞获得转移能力以及对化疗药物产生耐药性[17]。但目前针对宫颈癌的lncRNA-NEAT1研究少见。本研究结果显示，宫颈癌组及CIN组患者血清lncRNA-NEAT1的相对表达水平均高于对照组，宫颈癌患者血清中lncRNA-NEAT1的相对表达水平较CIN患者升高，这提示lncRNA-NEAT1表达上调参与宫颈癌的发生与发展。目前其表达上调的机制尚不清楚，可能与lncRNA-NEAT1的转录后调控异常有关。Fan等[18]的研究表明，lncRNA-NEAT1受到微小RNA(microRNA，miRNA)-18a-5p在转录后水平上的抑制，肿瘤中miRNA-18a-5p的表达下调导致lncRNA-NEAT1的稳定性增高，引起lncRNA-NEAT1表达水平升高。

我们进一步分析了宫颈癌患者血清lncRNA-NEAT1表达水平与临床病理特征的关系，结果显示，血清lncRNA-NEAT1表达水平可能与宫颈癌分化程度有关(P<0.05),而可能与年龄、FIGO分期、淋巴结转移、肿瘤直径无关(P>0.05)，这表明lncRNA-NEAT1可能参与调节宫颈癌细胞的分化过程。有研究表明，宫颈癌中lncRNA-NEAT1能够作为分子支架结合miRNA-133a并抑制其功能，导致miRNA-133a表达水平下降，进而引起其靶基因SRY盒转录因子4的表达升高，而SRY盒转录因子4又可激活核因子κB通路，最终导致肿瘤细胞恶性转化[19]。

综上所述，宫颈癌患者血清中lncRNA-NEAT1呈高表达，且与肿瘤分化程度相关，其或可成为宫颈癌的有效标志物之一。本研究尚存在一定局限性，如样本量较少，这可能使研究结果产生一定程度的偏倚。因此，在今后的研究中应开展更大样本量的研究，以进一步验证本研究结果。