市售天麻饮片6种活性成分与抗氧化活性的相关性研究

刘思婷，单鸣秋，郭书臣

天麻为我国传统名贵中药，具有治疗头晕、头痛、抗惊厥、镇静、降血压等药理作用。天麻中含量较高的成分是天麻素，现代药理研究证明药理作用与天麻相似，被认为是天麻的主要活性成分。但是仍有较多文献指出天麻中所含香荚兰醇及巴利森苷类成分也具有较强的生理活性，尤其是巴利森苷类在天麻中含量超过了天麻素与对羟基苯甲醇的含量。本研究采用高效液相色谱（HPLC）法同时测定搜集于不同产地、不同药店的市售天麻饮片中天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C6种活性成分的含量。

有较多研究表明，天麻还具有显著的抗氧化活性作用。近年来，人们对抗氧化食品和药物日渐热衷，天麻作为一味天然纯植物药物，抗氧化性显著，毒副作用较少，在抗氧化方面具有极佳的研究和开发价值。体外评价抗氧化活性的方法包括化学方法和生物学方法，主要表现在清除自由基、抑制脂质的氧化降解、抑制促氧化剂和还原能力几个方面。其中清除1，1-二苯-2-苦基肼（DPPH）自由基方法快速、简便，是目前应用最广泛的一种植物提取物体外抗氧化活性评价方法。本研究自2019年1—6月以HPLC-DPPH法评价天麻的抗氧化活性。结合天麻6种活性成分含量与抗氧化活性测定结果，探讨天麻活性成分与天麻抗氧化活性之间的相关性，以期为天麻抗氧化方面的开发利用提供理论依据。

1 仪器与试剂

Shimadzu Librorael-40SM型电子分析天平，精确至0.01 mg；WATERSALLIANCE-2695 HPLC系统（配PDA检测器，美国WATERS公司）；KQ-500B超声清洗仪；Anke TGL-16B高速离心机（上海安亭科学仪器厂）。天麻素、香荚兰醇对照品，均购自南京泽朗医药科技有限公司，批号分别为00256-2013、01083-2013，对羟基苯甲醇、巴利森苷C、巴利森苷B、巴利森苷A、对照品，均购自南京森贝伽生物有限公 司，批 号 分 别 为2014-0192、2014-0080、2014-0079、2014-0078，所有对照品纯度均≥98%。DPPH（纯度＞97.0%，梯希爱上海化成工业）；水为纯净水，甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。共收集29批不同产地天麻饮片，购自江苏省内各大药店，均经鉴定为兰科天麻属植物天麻Gastrdia elata B1.的干燥块茎切片。

2 实验方法

2.1 溶液的制备

2.1.1 天麻对照品的制备 取各对照品加甲醇-水（3∶97）混合溶液制成混合对照品溶液：含天麻素60.30μg/mL、对羟基苯甲醇92.30μg/mL、香荚兰醇3.02μg/mL、巴利森苷A310.86μg/mL、巴利森苷B95.54μg/mL、巴利森苷C445.72μg/mL。色谱图见图1。

2.1.2 天麻供试品的制备 取本品粉末（过三号筛）2 g，精密称定，放入锥形瓶中，加入稀乙醇50 mL，振摇2 h，精密称定质量，加热回流3 h后放置至冷却，再次精密称定质量，以稀乙醇补足缺失质量，振摇，滤过，取滤液10 mL，浓缩至近干，加甲醇-水（3∶97）溶液溶解残渣，移至25 mL容量瓶中，并用甲醇-水（3∶97）溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图：A为对照品溶液；B为供试品溶液

2.1.3 DPPH溶液配置 精密称取16.32 mg DPPH标准品，加入甲醇溶液，振摇至溶解，制成浓度为100μg/mL的DPPH溶液，锡箔纸密封放入冰箱-20℃储存。色谱图见图2A。

2.1.4 DPPH清除率实验供试品溶液配置 精密称取天麻样品粉末（过三号筛）各0.2 g置于锥形瓶中，精密加入40%甲醇水溶液4 mL，摇匀，塞住瓶口，超声（功率120 W，频率40 kHZ）45 min，取出，以40%甲醇水溶液补足缺失重量，放入高速离心机，4 000 r/min离心10 min，取上清液，再在10 000 r/min条件下离心10 min，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL按照“2.1.3”项下配置的DPPH溶液0.5 mL避光反应60 min，0.45μm微孔滤膜滤过，即得。色谱图见图2B。

2.2 色谱条件

2.2.1 活性成分含量测定 色谱条件Hypersil C色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱温：30℃；流动相为0.5%醋酸水溶液-0.5%醋酸甲醇溶液；体积流量：0.8 mL/min；检测波长270 nm；进样量：20μL。

2.2.2 DPPH清除率实验 色谱条件Hedera ODS-2色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm）；柱温：30℃；流动相：0.2%甲酸水溶液-0.2%甲酸甲醇溶液；体积流量：1 mL/min；检测波长：520 nm；进样量：10μL。

图2 高效液相色谱图：A为DPPH溶液；B为供试品溶液

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系 精密量取5 mL混合对照品溶液，移至10 mL容量瓶中，加水至刻度。加入甲醇-水（3：97）混合溶液，以倍比稀释法制成系列对照品溶液，在“2.2.1”项色谱条件下，每个质量浓度进三针，分别进样20μL，测定峰面积。以质量浓度（x，μg/mL）与峰面积平均值（y）进行线性回归。结果见表1，数据显示6种活性成分线性关系均较好，均r≧0.999 3。

2.3.2 精密度试验 取编号为S9的天麻样品，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，并按“2.2.1”项下色谱条件连续进样6针，进样量20μL，记录各峰面积并计算RSD。结果见表2，均RSD＜3%，表明精密度良好。

表1 天麻6种成分的回归方程

2.3.3 稳定性试验 取编号为S9的天麻样品，按“2.1.2”项下方法制成供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件分别于0、1、2、4、6、9、12、18 h各进样一次，共计8次，每次20μL，记录各峰面积，计算RSD。结果见表3，均RSD＜3%，表明供试品溶液中6种成分在18 h内稳定。

2.3.4 DPPH清除率实验反应时间考察 精密称取样品0.2 g，按照“2.1.4”项下制备供试品溶液，加入100μg/mL DPPH溶液0.5 mL，分别反应30～120 min（间隔均为10 min），结果见图3。如图所示，样品DPPH自由基清除率为24.96%～48.32%，其中反应达到60 min时，天麻对DPPH清除率达到最大值，60 min以后逐渐下降并趋于平稳。本实验选择60 min为样品与DPPH的反应时间。

2.3.5 DPPH清除率实验反应浓度考察 精密量取DPPH溶液，加甲醇分别制成浓度为400、350、300、250、200、150、100、50μg/mL的DPPH对照品溶液。

表2 天麻6种成分的精密度

表3 天麻6种成分的稳定性

图3 天麻30～120 min内DPPH自由基反应动力学

精密称取样品0.2 g，共7份，按照“2.1.4”项下制备供试品溶液，分别加入上述不同浓度的DPPH对照溶液0.5 mL，反应60 min，结果见图4。图示随着DPPH溶液浓度增大，DPPH自由基清除率不断下降，其中浓度为400μg/mL时清除率达到最小，小于10%，浓度为100μg/mL时清除率达到最大值，接近60%，因而本文选取DPPH浓度100μg/mL作为反应浓度。

图4 不同浓度的DPPH自由基清除率

3 实验结果

3.1 6种活性成分含量测定 取29批天麻样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下色谱条件进样分析，用外标法计算其中的天麻素、香荚兰醛、香荚兰醇、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛、巴利森苷B、巴利森苷A、巴利森苷C的含量，其结果见表4。

3.2 DPPH清除率 取29批天麻样品，按照“2.1.4”项下方法制备供试品溶液，在“2.2.2”项色谱条件按下进样，每次进样10μL，测各峰面积，并根据下列公式计算清除率。结果见表5。

清除率=｛（A-Ai ） /A｝×100%。其中，A 为DPPH溶液0.5 mL+40%甲醇溶液0.5 mL的峰面积；Ai为各样品所制成的供试品溶液的峰面积。

4 讨论

天麻饮片6种活性成分的含量结果显示天麻饮片中巴利森苷类成分含量最高，按照其含量高低排序为巴利森苷A＞巴利森苷B＞巴利森苷C；天麻素含量次之；对羟基苯甲醇与香荚兰醇的含量最低。同时，除少数几批外，大部分饮片中天麻素含量越高，巴利森苷类成分的含量也越高。而从化学结构看，巴利森苷B、A、C均为柠檬酸与天麻素结合而成的酯类。由此说明，巴利森苷类成分可能与天麻素存某种相互转化或相互依存的内在联系。

表4 29批天麻饮片中6种成分的百分含量/%

表5 29批天麻样品的DPPH自由基清除率

DPPH清除率实验结果显示，天麻饮片反应1h后的DPPH自由基清除率达到41.94%～93.91%，说明天麻具有很强的抗氧化活性。其中，样品S1～S4清除率为41.94%～54.94%，样品S5～S29清除率为64.35%～93.91%，最高清除率高于最低清除率的两倍。说明不同产地不同批次天麻饮片的抗氧化活性存在差异。

结合29批样品6种活性成分的含量测定的结果与天麻饮片DPPH自由基清除率结果分析：（1）天麻素过去一直被认为是天麻的主要活性成分，利用EXCEL对天麻素含量与DPPH自由基清除率结果进行线性拟合，结果ŷ=6.396 9x+76.999，r=0.068＜0.1，说明天麻素含量与天麻抗氧化活性无明显相关性；（2）利用EXCEL分别对对羟基苯甲醇、香荚兰醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的含量与DPPH自由基清除率结果进行线性拟合，结果相关系数r分别为0.148、0.155、0.122、0.023、0.073。说明对羟基苯甲醇、香荚兰醇、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C的含量与天麻抗氧化活性极弱正相关或无明显相关性。（3）有研究表明，植物中的抗氧化活性可能与其总酚含量有关，总酚含量越高，抗氧化活性越强。本研究中6种活性成分均为酚性成分，同时也是天麻中含量较高的酚性成分，并且巴利森苷类成分可能与天麻素存在某种相互转化或相互依存的内在联系。因此研究6种活性成分与天麻抗氧化活性的相关性存在意义。利用EXCEL对6种活性成分含量总和与天麻饮片DPPH自由基清除率进行线性拟合，结果ŷ=1.213 6x+82.472，r=0.050＜0.1，说明6种活性成分的含量总和与天麻饮片DPPH自由基清除率也无明显相关性。

综上所述，天麻任意一种活性成分或6种活性成分的总量与DPPH自由基清除率均无明显关联性，可能存在其他有效清除自由基的成分。或者，虽然所测的6种活性成分均为天麻酚性成分，但中药材中的各种成分往往具有协同作用，抗氧化活性可能是由于多种活性成分的协同作用，而并不仅仅是单个成分或几个成分作用的简单叠加。