葛根素联合γ突触核蛋白-微小RNA对肺癌H1299细胞增殖凋亡的影响

邹华兰，曾健梅，冷兴强，钟晶宇

肺癌是对人类身体健康威胁最大的恶性肿瘤之一，尽管近几十年来肺癌的治疗技术有所进步，但病人5年生存率仍然不高，如何有效提高肺癌病人的生存率一直是研究的热点。葛根素是中药葛根的有效成分之一，除了具有抗炎、抗氧化和降糖等药理活性外，还在包括肺癌在内的多种肿瘤中表现出较好的抗肿瘤活性。近年来有研究指出，葛根素联合γ突触核蛋白（synuclein gamma，SNCG）-siRNA可协同抑制膀胱癌细胞生长。SNCG是突触核蛋白（synucleins）家族成员，参与神经递质的释放，与帕金森病等神经退行性疾病密切相关；此外，SNCG还在乳腺癌、子宫内膜癌和结直肠癌等肿瘤组织中异常表达，可影响细胞生物学功能，参与肿瘤的发生发展。有研究报道，SNCG在肺癌组织中高表达，可通过激活AKT促进癌细胞增殖。本研究自2019年2－6月研究葛根素联合SNCG-siRNA抗肺癌的可行性，并探讨其可能的分子机制，以期为肺癌的治疗提供新线索。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 肿瘤增殖抗原（Ki67）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）蛋白和Bcl-2相关X蛋白（Bax）抗体（Santa Cruz），SNCG、细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体（Ab‐cam）。脂质体2000和Trizol试剂（Invitrogen）。二氧化碳恒温培养箱（Thorma），流式细胞仪（Becton Dickinson）公司，酶标仪（Bio-Rad）。

1.2 细胞培养 H1299细胞采用添加有10%胎牛血清和100 U/mL青链霉双抗的RPMI1640培养基在5%二氧化碳、饱和湿度和37℃恒温培养箱中常规培养。每天观察，待细胞贴壁80%时，以0.25%胰蛋白酶消化2 min，按照1∶2～1∶3比例传代。取生长状况良好的第3代对数生长期细胞进行实验。

1.3 葛根素浓度筛选实验 采用MTT法检测。将对数生长期的H1299细胞以每孔10个接种至96孔细胞板上后，于恒温培养箱内培养过夜。次日，加入含葛根素终浓度分别为0、20、40、80、160和320μg/mL培养液，其中每个梯度设置5个复孔，并以无细胞的培养液作为空白对照。孵育24 h后，弃培养液，每孔加入浓度为5 g/L MTT工作液20μL，孵育4h后，每孔加入二甲基亚砜150μL，震荡反应10 min后，采用酶标仪检测各处理组细胞在570 nm处的光密度（OD）值。根据公式：存活率（%）=（药物组OD－空白组OD）/（对照组OD－空白组OD）×100%计算出各处理细胞的存活率，并根据100%-存活率（%）值计算出葛根素作用24 h下的半抑制浓度IC50。

1.4 实验分组和细胞转染 将对数生长期的H1299细胞以每孔10个接种至6孔细胞板上后，于恒温培养箱内常规培养。实验分为NC-siRNA组（转染阴性对照NC-siRNA）、SNCG-siRNA组（转染SNCG干扰序列SNCG-siRNA）、葛根素+NC-siRNA组（转染NC-siRNA后给予150μg/mL葛根素处理24 h）和葛根素+SNCG-siRNA组（转染SNCG-siRNA后给予150μg/mL葛根素处理24 h）。待细胞汇合度达75%时，参照脂质体2000说明书步骤根据实验分组进行转染。其中，SNCG-siRNA（正向引物：5’-UGACGGAAGCAGCUGAGAATT-3’，反向引物：5’-UUCUCAGCUGCUUCCGUCATT-3’）及NC-siRNA（正向引物：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’，反向引物：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’）由上海吉玛制药技术有限公司合成。转染48h后收集NC-siRNA组和SNCG-siRNA组细胞，采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）分别检测细胞中SNCGmRNA和蛋白的表达水平以评价转染效果。

1.5 SNCG mRNA表达的检测 采用RT-PCR检测。以Trizol试剂提取H1299细胞的总RNA后，以紫外分光光度计检测RNA的浓度。参照逆转录试剂盒说明书将RNA进行逆转录后，将逆转录产物cDNA作为模板，根据定量PCR试剂盒说明书进行PCR扩增。其中，PCR引物（SNCG正向引物：5’-TGACCTCAGTGGCCGAGAA-3’，反 向 引 物：5’-GCCTCACCCTCCTGTTGG-3’；GAPDH正向引物：5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’，反向引物：5’-TGATGGCAACAATGTCCACT-3’）由上海生工生物工程有限公司合成。以GAPDH为内参，2法计算各组细胞中SNCGmRNA的表达水平。

1.6 SNCG、Ki67、CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表达的检测 采用Western blot检测。向待测的H1299细胞中加入RIPA裂解液提取总蛋白后，采用BCA法对总蛋白的浓度进行定量。将蛋白样品与等体积上样缓冲液混匀后，置于沸水浴中煮沸5 min。参照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书制备SDSPAGE凝胶后，按照每孔80μg蛋白样品的上样量行电泳分离。电泳结束后，电转至PVDF膜上。将膜浸入含5%脱脂奶粉的封闭液中封闭2 h后，以特异性 一 抗（SNCG 1∶1 000、Ki67 1∶500、CyclinD1 1∶1 000、Bcl-2 1∶800、Bax 1∶800和GAPDH 1∶1 000）4℃下孵育过夜。封闭液洗膜后，再以二抗（1∶2 000）室温下孵育1 h。经ECL显影后，以GAPDH为内参，采用凝胶成像系统扫描分析。

1.7 细胞增殖能力检测 采用MTT法和平板克隆实验检测。（1）MTT实验：将对数生长期的H1299细胞以每孔10个接种96孔细胞板上后，置于培养箱内培养过夜。将其按照1.4进行分组并处理后，采用MTT法检测各组细胞的存活率，详细步骤参照1.3。（2）平板克隆实验：将对数生长期的H1299细胞以每孔10个细胞）接种至6孔细胞板上后，常规培养过夜。按照1.4分组处理后，继续在培养箱内培养。待有肉眼可见的集落出现时终止培养。弃培养液，用磷酸缓冲液洗涤细胞3次后，以甲醇和结晶紫分别对细胞进行固定和染色，洗去染液后，室温下干燥。采用显微镜每个样品随机选取6个视野检测细胞的克隆数。其中，将超过15个细胞的集落作为一个有效克隆，以（克隆数/种植细胞数）×100%的值表示细胞的克隆形成能力。

1.8 细胞凋亡能力检测 采用流式细胞仪检测。收集处理结束后的NC-siRNA组、SNCG-siRNA组、葛根素+NC-siRNA组和葛根素+SNCG-siRNA组细胞，经磷酸缓冲液洗涤2次后，参照Annexin-V/FITC凋亡试剂盒说明书上流式细胞仪检测各组细胞的凋亡能力。

2 结果

2.1 葛根素对肺癌H1299细胞增殖的影响 与0 μg/mL处理组相比，20、40、80、160和320μg/mL葛根素刺激24 h后H1299细胞存活率均明显降低（P＜0.05）。见表1。同时，计算出24 h作用时间下葛根素的IC50为150.40μg/mL。故后续选用浓度为150 μg/mL进行实验。

表1 不同浓度葛根素刺激后各组细胞的存活率/（%，x±s)

2.2 转染SNCG-siRNA对肺癌H1299细胞中SNCG表达的影响 与NC-siRNA组相比，SNCGsiRNA组细胞中SNCG mRNA和蛋白的表达水平均明显降低（P＜0.05）。见表2。

表2 转染SNCG-siRNA后H1299细胞中SNCGmRNA和蛋白的表达/x±s

2.3 葛根素联合SNCG-siRNA对肺癌H1299细胞增殖的影响 与NC-siRNA组相比，葛根素+NC-siR‐NA组、SNCG-siRNA组和葛根素+SNCG-siRNA组细胞存活率和克隆形成率均明显降低（P＜0.05）；与葛根素+NC-siRNA或SNCG-siRNA处理组相比，葛根素+SNCG-siRNA处理组细胞存活率和克隆形成率进一步降低（P＜0.05）。见表3。

2.4 葛根素联合SNCG-siRNA对肺癌H1299细胞凋亡的影响 葛根素+NC-siRNA或SNCG-siRNA处理组以及葛根素+SNCG-siRNA处理组细胞凋亡率均明显高于NC-siRNA组（P＜0.05）；且葛根素+SNCG-siRNA处理后的作用效果较葛根素+NC-siR‐NA或SNCG-siRNA处理更为显著（P＜0.05）。见图1和表3。

表3 各组细胞存活率、克隆形成率和凋亡率的比较/（%，x±s)

2.5 葛根素联合SNCG-siRNA对H1299细胞中Ki67、CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 与NC-siRNA组相比，葛根素+NC-siRNA或SNCG-siR‐NA处理组以及葛根素+SNCG-siRNA处理组细胞中Ki67、CyclinD1、Bcl-2蛋白的表达水平均明显降低，而Bax蛋白的表达水平均明显升高（P＜0.05）；与葛根素+NC-siRNA或SNCG-siRNA处理组相比，葛根素+SNCG-siRNA对H1299细胞中Ki67、CyclinD1、Bcl-2蛋白表达的抑制作用及对Bax蛋白表达的促进作用更为明显（P＜0.05）。见图2和表4。

3 讨论

由于中药抗肿瘤具有多靶点、全方位和不良反应小等优势，使得中4药在肿5瘤治疗中占据着重要地位。作为中草药葛根的主要有效成分葛根素在抗肿瘤方面1的作用备受学者们的关注。Jiang K等研究指出，葛根素可通过调控mTOR/p70S6K抑制膀胱癌细胞增殖。Zhang等报道，葛根素可呈剂量依赖性通过MAPK信号通路诱导肝癌细胞凋亡。本研究结果表明葛根素可抑制肺癌H1299细胞增殖并促进细胞凋亡。这提示葛根素具有较好的抗肺癌的作用。

SNCG基因位于人10q23染色体上，其编码的蛋白质由127个氨基酸组成，在大脑丘脑和黑质中高表达，在结肠、卵巢和心脏等部位低表达，而在肝、乳腺和肾等器官中几乎不表达。Ji等在乳腺癌中首次分离并报道了SNCG，并指出SNCG在晚期乳腺癌组织中高表达，且其表达同乳腺癌病理分期呈显著正相关。越来越多的研究发现，SNCG在结直肠癌、卵巢癌和膀胱癌等肿瘤中异常高表达，且可通过调控细胞增殖和凋亡等在肿瘤的发生发展过程 中 发 挥 着 重 要 作 用。Changru等指 出，RNA干扰介导的SNCG沉默可通过下调Akt/Erk的磷酸化抑制胃癌SGC7901细胞的体外和体内生长。李文怡指出，沉默SNCG表达可抑制子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、侵袭、迁移并诱导细胞周期阻滞和凋亡。本研究表明RNA干扰SNCG表达可抑制肺癌H1299细胞增殖并促进细胞凋亡。这提示SNCG在肺癌的发生发展过程中可能发挥着致癌基因的作用，而靶向干扰其表达可抑制肺癌的恶性进展。

本研究以葛根素刺激SNCG干扰后的H1299细胞后发现，H1299细胞增殖和克隆形成能力下降以及细胞凋亡能力升高幅度较葛根素或SNCG干扰单独处理更为明显。结果表明，葛根素联合SNCG干扰可协同抑制肺癌H1299细胞增殖并促进细胞凋亡。Ki67是细胞增殖过程中不可或缺的核抗原，与有丝分裂密切相关，可作为肺癌细胞增殖的重要指标；CyclinD1是一种重要的细胞周期蛋白，在细胞从G1期进入S期过程中发挥着重要的促进作用；同时也是一种癌基因，在肺癌细胞增殖凋亡过程中发挥着重要作用；Bcl-2和Bax是Bcl-2家族成员，分别在肺癌细胞凋亡过程中发挥着抑制和促进的作用。有报道证实，siRNA-SNCG通过降低Bcl-2表达来增加放射对乳腺癌MDA-MB231细胞毒性和凋亡；敲除SNCG可通过下调Cyclin D1、Ki67等蛋白的表达增强胶质瘤移植瘤对紫杉醇的药物敏感性。本研究进一步检测结果表明葛根素联合SNCGsiRNA可协同下调Cyclin D1、Ki67、Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白的表达。这提示，葛根素和SNCG-siRNA可能通过协同上调Bax和下调Cyclin D1、Ki67、Bcl-2蛋白的表达发挥协同抗肺癌的作用。

图1 流式细胞仪检测各组细胞凋亡

表4 各组细胞中Ki67、CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白的表达水平/x±s

图2 Western blotting检测各组细胞中Ki67、CyclinD1、Bcl-2和Bax蛋白的表达

综上所述，葛根素联合SNCG-siRNA可协同抑制肺癌H1299细胞增殖并促进细胞凋亡，其作用机制可能与共同下调Cyclin D1、Ki67、Bcl-2蛋白和上调Bax蛋白的表达有关。本研究仅是从细胞水平上、单种肺癌细胞系中阐述了葛根素和SNCG-siR‐NA联合的作用效果及潜在机制，后续将在多种肺癌细胞系和动物水平上进一步验证。