肥胖2型糖尿病模型OLETF大鼠不同病程阶段肝脏水通道蛋白9 mRNA的表达

段玉敏，袁振芳

水通道蛋白（aquaporin，AQP）是广泛存在于多种细胞的细胞膜上的一大类跨膜蛋白，其主要作用是用来运输水分子。目前已经发现的水通道蛋白有11个亚型（AQP0～AQP10）。本实验研究的AQP9主要是在肝细胞表面表达的一种特异性水-甘油通道蛋白，其与在脂肪细胞表面表达的特异性水-甘油通道蛋白AQP7在糖脂代谢过程中存在协同作用。既往研究证实AQP7和AQP9可能在肥胖和糖尿病发展的不同病程阶段发挥了一定作用，目前这两类蛋白与糖脂代谢的关系还不十分清楚。本研究自2019年3-9月采用肥胖的2型糖尿病大鼠模型-OLETF大鼠作为研究对象，从动物角度揭示肝脏AQP9在肥胖和糖尿病病程发展中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组及实验方法 选取30只雄性OLETF（Otsuka Long-Evans Tokushima fatty）大鼠为实验组，同品系的18只LETO（Long-Evans Tokushi‐ma Otsuka）大鼠为正常对照组。给予常规饲料喂养，饮用清水至8周龄，从两组中分别随机抽取6只予50%葡萄糖按2 g/kg剂量口服行葡萄糖耐量试验（OGTT），同时测定体质量、胰岛素、三酰甘油、总胆固醇水平，试验后3 d称重，给予2%戊巴比妥40 mg/kg腹腔内注射处死取肝脏组织冻存。剩余24只OLETF大鼠随机分成两组，一组为未治疗组（OLETF组）12只，给予等体积纯净水6.0 mL/kg灌胃；另一组为盐酸二甲双胍治疗组（OLETF/M组）12只，给予盐酸二甲双胍300 mg·kg·d灌胃。同时对照组的12只LETO大鼠按照6.0 mL/kg给予等体积的纯净水灌胃。自8周起，所有实验大鼠均饮用100 g/L的蔗糖水代替普通饮用水，仍使用常规饲料喂养。在18周龄和28周龄，分别从三组中采用随机数字表法抽取6只大鼠仍以50%葡萄糖按2 g/kg剂量口服行葡萄糖耐量试验。符合OGTT 120 min血糖＞11.1 mmol/L或血糖峰值＞16.71 mmol/L两条中的任何一条诊断为糖耐量异常；OGTT 120 min血糖＞11.1 mmol/L和峰值血糖＞16.71 mmol/L两个条件都符合诊断为糖尿病；同8周基线时一样测定大鼠的各项生化指标。OGTT试验后3 d处死取肝脏组织冻存。实验中充分保证动物福利、给予动物人道关怀，动物处置符合伦理学原则。

1.2 基本生化指标的测定 用氧化酶法测定血糖及血脂，血糖分别测定，血脂为同一批测定；用胰岛素放射免疫分析试剂盒同一批测定血清胰岛素。

1.3 肝脏组织AQP9 mRNA的表达用Real time PCR分批测定 取100 mg肝脏组织在液氮下研磨后用Trizol提取总RNA，逆转录为cDNA。取4μL cDNA（50μL体系）在ABIPrism 7600定量PCR仪上进行Real time PCR，实验条件：预变性95℃10 min；95℃变性15 s，60℃退火1 min，共扩增40个循环。扩增曲线用7300 SDS软件观察，并进行产物定量分析。试验组相对于对照组的变化倍数用2法表示。引物序列见表1。

表1 Real-time PCR引物序列

2 结果

2.1 三组大鼠体质量、三酰甘油、总胆固醇指标比较 见表2。

2.1.1 体质量 随周龄增加，OLETF组较LETO组肥胖加重，8周体质量增加11.16%（P＜0.05），18周体质量增加17.47%（P＜0.01），28周体质量增加26.92%（P＜0.01），OLETF/M组与同周龄OLETF组大鼠比较，两组体质量差异无统计学意义，与同周龄对照LETO组大鼠比较肥胖加重，未见盐酸二甲双胍对体质量有明显影响。

表2 三组大鼠体质量、三酰甘油、总胆固醇指标比较/±s

2.1.2 三酰甘油及胆固醇 三酰甘油水平：8周龄OLETF组与对照LETO组差异无统计学意义，18周OLETF组较LETO组增高2.86倍（P＜0.01），28周OLETF组较LETO组增高7.58倍（P＜0.05）；而OLETF/M组在18周较LETO组仅增加2.31倍（P＜0.01），在28周较LETO组仅增加3.66倍（P＜0.05），18和28周OLETF/M组的三酰甘油水平均低于OLETF组（P＞0.05）。胆固醇水平：OLETF/M组在28周龄较OLETF组下降24.2%（P＜0.05），其余各周龄各组间差异无统计学意义。

2.2 三组大鼠各周OGTT血糖及胰岛素比较见表3。

2.2.1 血糖 实验期间对照组LETO大鼠血糖均正常；OLETF组在8周龄血糖正常，OLETF组及OLETF/M组在18周龄均达糖尿病诊断标准，血糖水平OLETF/M组低于OLETF组，在OGTT 60 min时差异有统计学意义（P＜0.01）。在28周龄，OLETF组血糖进一步增高，糖尿病加重，OLETF/M组大鼠血糖下降，均恢复为糖耐量异常。

2.2.2 胰岛素 8周龄各组大鼠胰岛素水平相同；随血糖增高，糖尿病加重，OLETF组和OLETF/M组的胰岛素水平均高于LETO组，说明OLETF大鼠胰岛素抵抗加重。但OLETF与OLETF/M两组间的胰岛素在各点均差异无统计学意义，虽然在28周OLETF/M组服用盐酸二甲双胍使血糖水平缓解为糖耐量异常，但截至28周结束未观察到二甲双胍降胰岛素的作用。

2.3 肝脏AQP9 mRNA的表达 OLETF组肝脏AQP9 mRNA的表达在8周龄、18周龄及28周龄分别是同周龄LETO组的0.9倍、1.0倍和0.7倍，OLETF/M组肝脏AQP9 mRNA的表达则分别是同周龄LETO组的0.9倍、0.6倍及0.5倍。OLETF/M组肝脏AQP9 mRNA的表达低于OLETF组，但两组之间及与同周龄LETO组间对比差异无统计学意义。

3 讨论

1997年Kuriyama等在分析人类脂肪组织基因序列时发现了一类水甘油通道蛋白-水通道蛋白9（AQP 9），它在肝脏、大脑、消化道、睾丸等多个组织分布，对水、多元醇、甘油、腺嘌呤、尿素、单羧酸酯、嘧啶、氨以及亚砷酸盐等均具有通透性。AQP9基因最初是从脂肪组织中克隆得到的，它的生理功能是甘油进出脂肪细胞的通道，参与三酰甘油的合成代谢及分解代谢以维持脂肪代谢的平衡。在全身各组织器官中，AQP9在肝脏中的表达水平最高，免疫荧光显示AQP9蛋白主要定位于肝细胞血窦面。甘油是体内联系葡萄糖、脂肪、蛋白质三大物质代谢的枢纽，它既与脂肪酸作用参与三酰甘油等脂质合成，也参与糖异生过程。生理条件下70%～90%的甘油最终在肝细胞内氧化分解，而AQP9是肝细胞对甘油摄取的转运通道。

脂肪组织分解产生的甘油通过脂肪细胞表面的水通道蛋白7（AQP 7）释放入血，进入血液的甘油通过肝脏表面的AQP 9转运入肝细胞，在糖脂代谢过程中，AQP7与AQP9的协同作用至关重要。水通道蛋白7和9把脂肪分解产生的甘油转运到肝细胞胞浆内，在甘油激酶作用下生成3-磷酸甘油，它是体内多种能量物质代谢的中间产物，并参与氧化供能，3-磷酸甘油通过糖异生生成葡萄糖或者被再次合成三酰甘油。AQP9基因被敲除的AQP9小鼠与野生型AQP9小鼠相比，血甘油及三酰甘油明显升高，饥饿状态下的血糖明显下降，说明AQP9参与了甘油的转运，在糖代谢过程中也发挥了重要作用。

表3 三组大鼠OGTT血糖及胰岛素比较/±s

本研究选择肥胖2型糖尿病模型OLETF大鼠，给予高糖饲养后取肝脏组织，大鼠在喂养到18周龄时全部达糖尿病标准，血清三酰甘油和胰岛素均增加，是典型的2型糖尿病病人具有的肥胖、高脂血症和胰岛素抵抗的特点。与文献报道相符。

实验观察到OLETF大鼠在8周时肝脏AQP9 mRNA的表达是同周龄LETO组的0.9倍，在18周龄和28周龄，OLETF组肝脏AQP9 mRNA的表达分别是同周龄LETO组的1.0倍及0.7倍。同时在糖尿病发展过程中，LETO组AQP9 mRNA表达为逐渐上调趋势，而OLETF组肝脏AQP9 mRNA表达则为先代偿性上调而后下调趋势。分析原因，这可能是由于LETO组大鼠随着周龄及体质量的增加，脂肪含量增加使脂肪组织分解代谢增强，需要释放入血的甘油浓度增加，肝脏AQP9 mRNA表达代偿性上调，可以促进更多的甘油进入肝脏合成三酰甘油。而OLETF组AQP9 mRNA表达先代偿性上调而后下调，可能是因为18周龄时因持续给予高糖饲养，大鼠体质量增加了17.47%，脂肪细胞需释放更多甘油引起AQP9代偿性上调，释放的甘油是糖异生的底物，大量甘油进入肝脏合成葡萄糖，使OLETF大鼠血糖大幅升高，糖尿病加重。在28周龄，OLETF组大鼠的肥胖状态及糖尿病加重，但肝脏AQP9表达却呈现下调，既往国内外动物实验及人体实验均证实，肥胖者体内脂肪组织AQP7表达下调，故分析AQP 9下调可能是由于脂肪细胞AQP7失代偿使表达减少，导致从脂肪细胞中排出的甘油减少，细胞内甘油浓度增加，脂肪细胞内脂肪合成增加，肥胖更加明显，AQP7表达下调，从而使由脂肪细胞释放的甘油减少进而导致肝脏AQP9表达同时下调。

盐酸二甲双胍是临床2型糖尿病病人治疗的基础用药，已有证据表明盐酸二甲双胍可以改善肥胖及2型糖尿病病人的胰岛素抵抗及脂代谢紊乱，且有较强的降糖效果，在不增加胰岛素分泌的同时可以改善胰岛素抵抗，使体质量不变或减轻。本实验选取盐酸二甲双胍，意在探讨其在改善胰岛素抵抗，治疗糖尿病的同时能否影响肝脏AQP9 mRNA的表达。用盐酸二甲双胍以300 mg·kg·d剂量给OLETF/M组大鼠灌胃，到28周龄，盐酸二甲双胍降低了OLETF/M组大鼠的血糖及血脂，与文献报道相符，但OLETF/M组体质量较同周龄OLETF组未见减轻，分析可能与饲养时间短有关，若延长饲养时间两组间可能会出现差异。盐酸二甲双胍使同周龄OLETF/M组肝脏AQP9 mRNA表达上调的幅度低于OLETF组（P＞0.05），虽两组间无统计学差异，但也表明盐酸二甲双胍既改善了糖脂代谢紊乱又抑制了肝脏组织AQP9的表达。为研究盐酸二甲双胍治疗肥胖与胰岛素抵抗的生理机制提供了新证据。

综上所述，肝脏组织的AQP9参与了肥胖和糖尿病的发生发展，盐酸二甲双胍既可以改善OLETF大鼠的糖脂代谢紊乱，又可以抑制AQP9 mRNA的表达。对水甘油通道蛋白中甘油代谢机制的研究，可以为治疗代谢综合征提供新方法。