下调HOX转录反义RNA对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、周期及侵袭能力的影响

叶惠荣，张玉娟，曹茵，王西跃，吴丽华，陈桂林，陈丽娟，袁惠玲

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TN‐BC）病人雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）表达均为阴性，约占乳腺癌的17%。TN‐BC因缺少PR、ER、HER2的表达，不能接受分泌治疗和抗HER2治疗的手段，目前临床上主要依赖化疗，但其乳腺癌细胞具有强转移和侵袭能力，导致相对其它类型乳腺癌，TNBC整体预后仍差。由于缺乏明确的治疗靶点，因此越来越多学者关注TNBC治疗靶点的研究。长链非编码RNA（Long Non-coding RNA，lncRNA）长度一般为200个核苷酸序列，不编码蛋白质，在X染色体灭活、染色质重塑、转录调节、细胞周期调控、MicroRNA活性、表观基因调节等生物过程均发挥重要作用。lncRNA HOX转录反义RNA（HOX Transcript Antisense RNA，HO‐TAIR）能够通过反式作用调节基因的表达。研究发现，HOTAIR在TNBC组织中表达水平升高，与TNBC的临床病理分期相关。但HOTAIR对TNBC细胞调控机制尚不清楚，本研究自2019年2—7月以TNBC细胞MDA-MB-231为模型，探究下调HO‐TAIR表达水平对MDA-MB-231细胞增殖、周期及侵袭能力的影响。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 RPMI 1640培养基（货号：C11875500BT）、胎牛血清（FBS）（货号：10091-148）均购自美国GIBCO公司；转染试剂Lipofectamine 2000（货号11668019）购自武汉科昊佳生物科技有限公司；阴性对照si-Control、si-HOTAIR由上海吉玛公司合成；兔抗人c-myc（货号BS94081）、兔抗人Ki-67（货号BS90768）、兔抗人PCNA（货号BS6438）、兔抗人MMP-9（货号BS6893）、兔抗人MMP-2（货号BS72289）、兔抗人内参β-Actin（货号：AP0060）均购自美国Bioworld公司；羊抗兔二抗（货号31466）购自美国Pierce公司；RNA提取试剂Trizol（货号15596026）购自英潍捷基（上海）贸易有限公司；PrimeScript逆转录-PCR试剂盒（货号DRR042A）购自南京赛鸿瑞生物科技有限公司；FC 500系列流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特有限公司；Multiskan FC酶标仪购自美国赛默飞世尔科技公司。

1.2 细胞培养和转染 细胞系：正常乳腺上皮细胞系MCF-10A、TNBC细胞系MDA-MB-231购自南京安研生物科技有限公司。MCF-10A细胞、MDA-MB-231细胞在相对湿度98%、5%二氧化碳、温度为37℃的培养箱中常规培养，培养液为含有1%青链霉素双抗、10%FBS的1640培养基，待细胞单层平铺培养瓶约80%时胰酶消化传代，收集对数生长期的细胞进行后续实验。细胞转染：实验分为对照组、si-阴性对照组、si-HOTAIR组。严格按照说明书操 作 将si-HOTAIR（5'-GAACGGGAGUACAGAGA‐GAUU-3'）和阴性对照si-Control（5'-TTCTCCGAAC‐GTGTCACGT-3'）转染至MDA-MB-231细胞中，细胞在6孔板中培养48 h后用做后续实验。

1.3 RT-qPCR检测MDA-MB-231细胞HOTAIR表达水平 使用RNA提取试剂Trizol提取各组细胞总RNA，PrimeScript逆转录-PCR试剂盒反转录得到cDNA，严格按照PCR试剂盒说明书操作，将cDNA稀释至25 ng/mL，然后加入到反应体系中，使用PCR仪对HOTAIR进行扩增。HOTAIR正向引物序列：5’-GGGTGTTGGTCTGTGGAACT-3’，反向引物序列：5’-CAGTGGGGAACTCTGACTCG-3’；内参GAP‐DH正 向 引 物 序 列：5’-CTTTGGTATCGTG‐GAAGGACTC-3’，反 向 引 物 序 列：5’-CAGT‐GGGGAACTCTGACTCG-3’，反应条件：首先在94℃条件下预变性300 s，随后94℃条件下变性30 s，65℃退火1 min，最后在60℃条件下延伸30 s，进行30个循环，60℃终末延伸5 min。各组设置6个复孔，采用2法对MDA-MB-231细胞HOTAIR表达水平进行定量分析。

1.4 MTT法测定MDA-MB-231细胞活性 将细胞以1×10个/孔接种到96孔板上，实验分组同“1.2”，每组设置6个复孔，培养过夜，待细胞贴壁后弃培养液，PBS清洗3次，加入不含血清的培养液继续培养。培养48 h后加入25μL MTT（5 mg/mL）溶液，孵育4 h后弃去孔内培养液，加入150μL DMSO溶液，100 r/min 37℃恒温震荡10 min，使用多功能酶标仪测定样品在570nm处吸光度（OD值）。根据公式计算细胞活性。细胞活性（%）=（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD-空白组OD）×100%。

1.5 流式细胞仪测定MDA-MB-231细胞周期 收集MDA-MB-231细胞，实验分组同“1.2”，设置6个复孔，离心后用预冷的PBS清洗3次，之后将细胞置于4℃70%乙醇中固定0.5 h，用预冷的PBS清洗3次，最后将细胞重悬于含有100μg RNaseA和40μg PI的PBS中，25℃避光孵育0.5 h，用流式细胞仪测定。

1.6 Transwell小室侵袭实验测定MDA-MB-231细胞侵袭能力 将Matrigel胶从-20℃冰箱中取出，4℃环境中过夜解冻，用1640培养液稀释至200μL/mL，之后涂抹到transwell板的滤膜上面（200μL/cm），37℃放置3 h，取出后在超净台上干燥过夜。按照“1.2”实验分组处理，设置6个复孔，将细胞以1×10个/孔接种到上室，同时下室加入600μL不含细胞的培养液，常规培养，待细胞贴壁后更换上室培养液，然后继续培养48 h，用棉签轻轻擦去Matri‐gel和上室内细胞，甲醇固定5 min，然后用PBS清洗3次，0.1%结晶紫染色5 min，PBS清洗3次后显微镜下拍照，每组随机选择6个视野计数，取平均值。

1.7 蛋 白 印 迹 法（western blotting，WB）测 定MDA-MB-231细胞c-myc、Ki-67、PCNA、MMP-9、MMP-2表达水平 使用RIPA法提取各组细胞蛋白并测定总蛋白含量，垂直电泳法分离所需目标蛋白，用BIO-RAD法将目标蛋白转至PVDF膜上，5%BSA将结合位点封闭1 h。加入兔抗人c-myc、兔抗人Ki-67、兔抗人PCNA、兔抗人MMP-9、兔抗人MMP-2、兔抗人内参β-Actin（稀释比例均为1∶1 000），4℃孵育过夜，加入羊抗兔二抗（1∶1 000），PBS清洗3次，37℃孵育0.5 h，PBS清洗3次，显色、曝光、凝胶成像设备观察。

1.8 统计学方法 使用SPSS22.0版软件对数据进行统计分析。数据以x±s表示，多组比较行单因素方差分析，两组均数相比行snk-q检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组MDA-MB-231细胞HOTAIR表达水平比较 与MCF-10A细胞组（1.06±0.13）相比，对照组MDA-MB-231细胞HOTAIR基础表达水平（1.85±0.21）升高（P＜0.05）。与对照组相比，si-HOTAIR组HOTAIR表达水平（1.34±0.15）降低（P＜0.05），si-阴性对照组（1.80±0.31），差异无统计学意义。

2.2 各组MDA-MB-231细胞活性比较 与对照组（102.64±3.29）%相比，si-HOTAIR组MDA-MB-231细胞活性（98.04±6.28）%降低（P＜0.05），si-阴性对照组（81.93±5.87）%无明显变化，差异无统计学意义。

2.3 各组MDA-MB-231细胞周期比较 与对照组相比，si-HOTAIR组MDA-MB-231细胞G0/G1期下调，主要阻滞在G2/M期，si-阴性对照组无明显变化，见图1。

图1 MDA-MB-231细胞周期：A为对照组；B为si-阴性对照组；C为si-HOTAIR组

2.4 各组MDA-MB-231细胞侵袭能力比较 与对照组相比，si-HOTAIR组MDA-MB-231细胞通过Matrigel到达滤膜底层的细胞数A明显减少［（35.66±8.04）个比（125.92±13.55）个，P＜0.05］，si-阴性对照组［（128.17±16.53）个］，差异无统计学意义。

2.5 各组MDA-MB-231细胞中c-myc、Ki-67、PCNA、MMP-9、MMP-2表达水平比较 与对照组、si-阴性对照组相比，si-HOTAIR组c-myc、Ki-67、PC‐NA、MMP-9、MMP-2表达水平降低（P＜0.05），si-阴性对照组差异无统计学意义，见图2和表1。

图2 MDA-MB-231细胞中c-myc、Ki-67、PCNA、MMP-9、MMP-2表达水平

3 讨论

TNBC相比其它类型乳腺癌，治疗及预后、基因表型和生物学行为有明显差异。研究发现TNBC病人3～5年期间生存率较低，10年后复发率与其它乳腺癌病人相当。因此，尽管TNBC侵袭性能力强，预后差，但如能找到合适的治疗靶点，TNBC仍有望临床治愈。

近几年，HOTAIR在乳腺癌组织中异常表达受到越来越多研究者的关注，研究发现，HOTAIR在TNBC病人外周血清和癌组织中表达水平升高，且在转移性TNBC病人中尤其高。乳腺癌组织中HOTAIR高表达，上调MCF-7细胞中HOTAIR表达水平后，细胞侵袭能力增强，提示HOTAIR高表达有助于提高乳腺癌细胞侵袭能力。李苗等构建MDA-MB-231细胞三维培养体系，发现RNA-HO‐TAIR表达水平升高。本研究证实，与MCF-10A细胞组相比，MDA-MB-231细胞中HOTAIR表达水平升高，说明在MDA-MB-231细胞中HOTAIR高表达，提示HOTAIR可能与TNBC有关。Liu等研究发现HOTAIR在肺癌组织和细胞系中的高表达，敲除CAV-1后能够下调HOTAIR表达水平，抑制肺癌细胞增殖和侵袭，提示HOTAIR有望成为治疗肺癌的新靶点。朱意等研究表明lncRNA-HOTAIR在前列腺癌癌组织中高表达，与前列腺癌细胞的生长及侵袭能力有关，使细胞G2期阻滞，G1期的下调。另有研究发现，HOTAIR-siRNA组子宫内膜癌细胞增殖水平、侵袭能力与迁移能力低于对照组和阴性对照组，提示lncRNA-HOTAIR参与子宫内膜癌的转移侵袭进程。本研究表明，与对照组、si-阴性对照组相比，si-HOTAIR组MDA-MB-231细胞活性、侵袭能力降低，细胞G0/G1期下调，主要阻滞在G2/M期，说明下调HOTAIR表达水平可抑制MDA-MB-231细胞增殖、阻滞细胞周期、降低侵袭能力，提示HO‐TAIR可能成为治疗TNBC的新靶点。

表1 MDA-MB-231细胞中c-myc、Ki-67、PCNA、基质金属蛋白酶9（MMP-9）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）表达水平/x±s

c-myc作为位于细胞核的原癌基因，具有诱导细胞增殖、分化、凋亡等作用，研究发现，下调抑制cmyc蛋白表达，可抑制TNBC细胞增殖。Ki-67蛋白具有200多个磷酸化部位，易受到相关蛋白酶作用，Ki-67蛋白是癌细胞增殖过程中必需的结合蛋白，是临床上常用评价细胞增殖标志物。PCNA在细胞核特异性表达，与细胞增殖活性相关，研究发现，抑制PCNA蛋白表达水平，能够抑制肝癌细胞增殖。本研究表明，与对照组、si-阴性对照组相比，si-HOTAIR组MDA-MB-231细胞中c-myc、Ki-67、PCNA蛋白表达水平降低，说明下调HOTAIR表达水平可能抑制c-myc、Ki-67、PCNA蛋白表达，提示下调HOTAIR可能通过降低c-myc、Ki-67、PCNA蛋白表达水平而抑制MDA-MB-231细胞增殖。基质金属蛋白酶（MMP）能够降解细胞外基质和基底膜促进肿瘤细胞侵袭和迁移，研究发现，miR-125a-5p能够通过调控PI3K/Akt信号通路，下调MMP-2、MMP-9表达水平，从而抑制乳腺癌细胞侵袭和迁移。杨彧、付雯研究发现TAGLN基因过表达可能通过下调MMP-2、MMP-9表达水平，从而抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭。本研究表明，与对照组、si-阴性对照组相比，si-HOTAIR组MDA-MB-231细胞中MMP-9、MMP-2蛋白表达水平降低，说明MMP-9、MMP-2蛋白表达水平可能受HOTAIR调控，提示下调HO‐TAIR水平使MDA-MB-231细胞侵袭能力下降可能通过抑制MMP-9、MMP-2蛋白表达实现。

综上所述，HOTAIR在MDA-MB-231细胞中高表达，下调HOTAIR表达水平可抑制MDA-MB-231细胞增殖、阻滞细胞周期、降低细胞侵袭能力。但是具体通过调控哪种信号通路影响MDA-MB-231细胞还有待进一步研究。