成纤维细胞生长因子受体2剪切突变体Ⅲc在膀胱癌中的表达以及与膀胱癌253J细胞多柔比星耐药的关系

李纪华，景治安，毛长青，刘彦军，孔春艳

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤。中国男性膀胱癌发病率高于女性，并且逐年上升。泌尿系肿瘤是膀胱癌最常见的亚型，占膀胱癌的90%以上。根据临床和病理类型，膀胱癌主要分为两类：浅表非肌层浸润性膀胱癌和进行性肌肉浸润性膀胱癌。化疗是膀胱癌的重要治疗方法之一。然而，肿瘤细胞通常以多种方式获得耐药性，使化疗效果较差。此外，在肿瘤细胞获得耐药性后，其他生物学行为可能会发生变化，这可能对肿瘤复发和进展产生重要影响。成纤维细胞生长因子受体2（FGFR2）剪切突变体FGFR2Ⅲc在膀胱癌细胞中的表达促进间充质-上皮细胞转变（MET），并使病灶转移能力增强。本研究选取143例膀胱癌组织标本，探讨FGFR2Ⅲc与膀胱癌发展和膀胱癌253J细胞对多柔比星耐药性的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月至2018年1月郑州市第一人民医院保存的膀胱癌组织标本143例，纳入标准：（1）均经病理学确诊；（2）病人临床资料完整，对标本保存及用途知情同意；（3）组织标本获取前未行放化疗等治疗。排除标准：（1）合并有其他恶性肿瘤；（2）复治病人。同时选取正常膀胱组织70例作为对照（来自开放手术的良性前列腺增生病人），膀胱癌组和正常膀胱组病人一般资料比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。组织取出后置于福尔马林固定液中。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

表1 膀胱癌组和正常膀胱组一般资料比较

1.2 膀胱癌253J细胞培养及耐药细胞株建立

人膀胱癌253J细胞系由西安交通大学研究所提供，用含胎牛血清的DMEM培养基进行培养，建立多柔比星耐药253J/DOX细胞系。在实验前，将253J/DOX细胞在不含多柔比星的正常培养基中培养1周。253J细胞系先在低浓度多柔比星（2×10g/L）的培养基中培养，稳定生长（3×10g/L）后逐渐增加药物浓度，6个月后，在含有1×10g/L多柔比星的培养基中培养。

1.3 MTT法检测

用胰蛋白酶消化321J细胞和253J/DOX细胞后，计数并调节细胞浓度，并以5 000细胞/孔的浓度接种在96孔板中用于常规过夜培养。弃去培养上清液，用含有不同浓度多柔比星的培养基培养，设置5个平行孔。48 h后，加入PBS 200μL，洗涤3次。每孔加入20μL MTT，在培养箱中孵育4 h；吸出PBS，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO）。酶标仪波长设置为490 nm检测吸光度。通过SPSS软件计算半数最大抑制浓度（IC）。

1.4 细胞划痕试验 在调节253J细胞和253J/DOX细胞的细胞浓度后，将细胞以5×10细胞/孔的密度接种在6孔板中，用PBS洗涤细胞3次，并加入无血清DMEM培养基中24 h。然后用200μL枪头垂直6孔板平面画横线，用PBS洗涤细胞3次，然后加入无血清培养基。在划痕后0、8、16 h记录照片。通过测量多个观察点的划痕宽度来计算划痕愈合率。

1.5 实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测 将逆转录反应产物浓度调节至0.2 g/L，通过SYBRGreen I嵌合荧光法在样品上样1μL进行实时PCR反应。GAPDH正向引物为5'-AT‐GGGGAAGGTGAAGGTCGG-3'，反向引物为5'-GACGGTGCCATGGAATTTGC-3'；FGFR2Ⅲc正向引物是5'-CCGGTGTTAACACCACGGACAAA-3'，反向引物是5'-CA GAACTGTCAACCATGCAGAGT‐GAAA-3'。

2 结果

2.1 膀胱癌组和正常膀胱组FGFR2Ⅲc mRNA表达比较 膀胱癌组FGFR2Ⅲc mRNA相对表达量（1.782±0.342）明显高于正常膀胱组（1.082±0.200），差异有统计学意义（t=15.839，P=0.000）。

2.2 FGFR2Ⅲc mRNA表达与膀胱癌临床病理特征关系 病理分级高级别、病理分期T2～T4期FG‐FR2Ⅲc mRNA相对表达量明显高于低级别和Ta～T1期（P＜0.05），见表2。

2.3 不同病理分级、病理分期病人性别、年龄比较 不同病理分级、病理分期病人性别、年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.4 253J和耐多柔比星253J细胞FGFR2Ⅲc mRNA相对表达量等比较 耐多柔比星253J细胞FGFR2Ⅲc mRNA相对表达量和最大半数抑制浓度明显高于253J细胞（P＜0.05），见表4。

2.5 253J和耐多柔比星253J细胞迁移率比较 耐多柔比星253J细胞迁移率（23.02±3.12）%明显低于253J细胞（64.48±2.01）%（t=32.291，P=0.000）。

2.6 253J和耐多柔比星253J细胞凋亡率比较 耐多柔比星253J细胞凋亡率（23.22±5.50）%明显低于253J细胞（43.32±4.44）%（t=20.331，P=0.000）。

表2 膀胱癌组织143例成纤维细胞生长因子受体2的剪切突变体Ⅲc（FGFR2Ⅲc）mRNA表达与膀胱癌病理特征关系/±s

表3 不同病理分级、病理分期病人性别、年龄比较

表4 253J和耐多柔比星253J细胞成纤维细胞生长因子受体2的剪切突变体Ⅲc（FGFR2Ⅲc）mRNA相对表达量比较/±s

3 讨论

化疗在膀胱癌的治疗中起着重要作用。然而，肿瘤细胞可能由于天然表达或长期受到化学治疗药物的作用获得各种抗药性基因，从而降低治疗效果甚至引起化疗失败。由多药抗性基因MDR1编码的蛋白质产物P-gp是具有多种底物的转运蛋白，并且是肿瘤中临床化学抗性的主要原因之一。P-gp在膀胱癌等肿瘤中的表达可导致肿瘤细胞对许多传统化疗药物产生耐药性，并与病人预后不良密切相关。已有研究通过增加浓度方法建立了人膀胱癌253J的253J/DOX耐药细胞系，与亲代细胞相比，253J/DOX细胞中P-gp呈现高表达并且对多柔比星具有显著耐药性，该结果表明多柔比星耐药253J细胞的耐药性表型与P-gp相关，耐药细胞系的建立可以为研究膀胱癌的化疗耐药性和肿瘤发展过程提供可靠的细胞模型。

FGFR是酪氨酸激酶受体，其通过与其相应的配体成纤维细胞生长因子（FGF）结合而介导细胞信号传导。FGFR在肿瘤发展中起关键作用，并且研究已经证实靶基因异常是由点突变，扩增和染色体易位引起的。在肿瘤进展等过程中，上皮产生的细胞可逐渐丧失上皮细胞的特征而获得间质细胞的相关表型，这种现象称为上皮-间质转化（EMT）。肿瘤细胞的局部浸润能力增强，但是向远处转移的能力减弱。间质肿瘤细胞在该过程中的主要作用是通过降解细胞外基质来帮助上皮肿瘤细胞实现远处转移。然而，在高级膀胱癌组织中，肿瘤细胞通常通过EMT失去上皮表型。Chaffer等发现FGFR2裂解突变体FGFR2Ⅲc在高级膀胱癌细胞中的表达使肿瘤细胞通过MET恢复上皮表型，然后形成肿瘤转移病灶。

本次研究结果显示，膀胱癌组和正常膀胱组FGFR2Ⅲc mRNA的表达明显高于正常膀胱组。差异具有统计学意义。提示膀胱癌细胞可通过上调FGFR2Ⅲc表达获得肿瘤病灶向远处转移。FGFR2Ⅲc mRNA的表达与膀胱癌的临床病理特征相关，FGFR2Ⅲc mRNA在高级病理分级和病理分期T2～T4中的相对表达显著高于低级和Ta-T1期。这表明FGFR2Ⅲc mRNA表达与肿瘤分期和分级密切相关，表明FGFR2Ⅲc参与膀胱癌的发病机制。FG‐FR2Ⅲc mRNA的相对表达和253J和耐多柔比星253J细胞的最大半抑制浓度显著高于253J细胞。与253J和多柔比星耐药的253J细胞的细胞迁移率相比，多柔比星耐药的253J细胞的迁移率和凋亡率显著低于253J细胞。分析原因是253J细胞对多柔比星产生耐药性后，通过MET重新得到上皮细胞表型，使体外迁移能力下降。据推测，EMT和MET都是肿瘤细胞衍生的化疗耐药表型中常见的现象。在临床化疗期间，肿瘤细胞经历这种表型变化，导致局部上皮细胞和间质细胞共存，这促进肿瘤细胞恶性生长和远处转移。在高级别膀胱肿瘤中，化疗后耐药细胞中FGFR2Ⅲc的高表达可能导致一些肿瘤细胞通过MET重新获得上皮表型，进而形成转移灶。

综上所述，FGFR2Ⅲc mRNA在膀胱癌组织中表达上调，与病理分级和病理分期有关，同时与253J细胞耐多柔比星、迁移有一定关系。