miR-187通过靶向胰岛素生长因子-1受体基因对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

孙建立，马志强

乳腺癌（breast cancer，BC）是全球女性面临的最严重威胁之一，乳腺癌的发病率和死亡率分别高达24.2%和15%，在女性恶性肿瘤中排名第一。目前治疗乳腺癌的主要方式是外科手术联合放疗及化疗等综合治疗，但患者的预后仍较差。并且，乳腺癌发生和进展的分子机制尚不清楚，给诊断和治疗带来了巨大的挑战。近年来，癌症的分子标志已成为乳腺癌研究的重要影响因素。微小RNA（microRNA，miRNA）被认为是一类新的内源性分子，是非蛋白质编码的小RNA分子，可通过直接切割靶mRNA或通过抑制其翻译来负调节转录后基因的表达。研究发现，异常的miRNA表达与各种人类癌症如乳腺癌、结肠癌和肺癌等肿瘤的发生和发展有关。已有研究证实，miR-187在肺癌、胃癌、卵巢癌等中异常表达，参与肿瘤的进展，与患者预后及总体生存率密切相关。近期报道显示，miR-187在乳腺癌中表达下调，但关于其在乳腺癌中的作用尚不清楚。胰岛素生长因子-1受体（insulinlike growth factor-1 receptor，IGF-1R）基因与多种恶性肿瘤进展有关，有研究显示，其可促进肿瘤细胞增殖、分化、周期进程还可抑制细胞凋亡。杨晓民等人发现，IGF-1R基因可促进乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和迁移。近期Han等研究发现，miR-187通过靶向肝细胞癌中的IGF-1R抑制肿瘤生长和转移。提示miR-187可能通过靶向IGF-1R在乳腺癌中发挥作用。因此，本研究旨在探究miR-187靶向IGF-1R调控乳腺癌细胞增殖和凋亡的分子机制，以期为乳腺癌的靶向治疗提供分子标志。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常乳腺上皮细胞株HBL-100及人乳腺癌细胞株MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3（美国ATCC细胞库）；DMEM培养基（美国Hyclone公司）；青霉素-链霉素、胎牛血清（杭州四季青生物材料有限公司）；RNA提取试剂盒、脂质体转染试剂Lipofectamine 2000（美国Invitrogen公司）；miR-187 mimics及对照mimics-NC（上海吉玛制药技术有限公司）；逆转录试剂盒、qRT-PCR检测试剂盒（日本TaKaRa公司）；MTT试剂（美国Sigma公司）；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Pro‐mega公司）；细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒、ECL化学发光试剂盒（碧云天生物技术研究所）；PCNA抗体、Cleaved Caspase-3抗体、IGF-1R抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗（美国Abcam公司）。

1.2 细胞培养

常规复苏人正常乳腺上皮细胞HBL-100和人乳腺癌细胞MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3，分别采用含10%胎牛血清的DMEM培养基（含1%青霉素-链霉素双抗）培养，并放置在体积分数5%二氧化碳、37℃培养箱中培养。每天观察细胞生长状态，及时更换新鲜培养基，收集处于对数增殖期的细胞进行后续实验。

1.3 细胞转染和分组

将对数生长期的乳腺癌MDA-MB-231细胞以胰酶消化，计数后接种到6孔板中，接种密度为2×10个/孔，于37℃继续培养，待细胞贴壁生长汇合度达60%时，利用Lipofectamine 2000转染试剂分别将miR-187 mimics、阴性对照mimics-NC转染至MDA-MB-231细胞，分别记为miR-187组和miR-NC组，同时设置未转染的MDAMB-231细胞为空白对照组。每组设置3个复孔，各组细胞在37℃培养箱中常规培养48 h，收集细胞测定相应指标。

1.4 qRT-PCR检测细胞中miR-187的相对表达水平

分别收集处于对数生长期的HBL-100、MDAMB-231、MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3细胞以及转染48 h后各组MDA-MB-231细胞，分别参照RNA提取试剂盒说明书提取细胞中总RNA，使用逆转录试剂盒合成cDNA，并以cDNA为模板，以U6为内参，使用qRT-PCR检测试剂盒进行PCR扩增。反应条件为：94℃4 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃20 s，共设40个循环。采用2法计算各细胞中miR-187相对表达水平。所用引物如下：

U6-F 5，-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3’，U6-R 5，-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。miR-187-F 5，-TCGTGGGTCGTGTCTTGTGTTGC-3’，miR-187-R 5，-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。

1.5 蛋白质印迹法（Western blotting）检测

分别收集转染48 h后各组MDA-MB-231细胞，加入适量细胞裂解液，在冰上提取总蛋白，以BCA法检测蛋白浓度，取等量蛋白样品行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，设置电压为110 V，蛋白分离后电转至PVDF膜上，将膜放置在含5%脱脂奶粉中封闭1 h，再分别加入PCNA一抗（1∶800稀释），Cleaved Caspase-3一抗（1∶800稀释），IGF-1R一抗（1∶800稀释），4℃过夜孵育，TBST洗膜后再加入二抗（1∶3 000稀释），室温下孵育2 h。TBST洗膜后，采用ECL化学发光，显色，转移至暗室，使用凝胶成像系统成像拍照，以GAPDH为内参，使用Image J软件分析各条带灰度值，计算目的蛋白相对表达水平。

1.6 MTT法检测细胞增殖能力

转染48 h后分别向各组MDA-MB-231细胞加入MTT溶液10μL，在37℃继续孵育4 h，取出培养板，去上清，再向每孔细胞中加入150μL二甲基亚砜，避光振荡反应10 min，待沉淀完全溶解后，使用酶标仪上检测细胞光密度值（OD值），波长为450 nm。实验重复3次。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡情况

采用0.25%胰蛋白酶消化转染后48 h各组MDA-MB-231细胞，离心收集细胞，加入100μL Binding buffer结合缓冲液，重悬细胞并制成1×10个/毫升的细胞悬液，向100μL细胞悬液中加入Annexin V-FITC 5μL，混匀后孵育15 min，再向细胞悬液中加入PI染液5μL，避光孵育15 min，立即上流式细胞仪检测，实验重复3次。

1.8 双荧光素酶报告基因实验

TargetScan等在线数据库预测发现miR-187与IGF-1R 3’-UTR存在靶向结合位点，提示IGF-1R可能是miR-187的直接靶基因。根据生物信息学预测结果分别扩增与miR-187结合的IGF-1R 3’-UTR序列及突变序列，即IGF-1R-Wt和IGF-1R-Mut，分别构建到荧光素酶报告载体上，该部分实验由上海吉玛制药技术有限公司完成。将构建好的重组载体质粒分别与miR-187 mim‐ic及对照mimics-NC共转染MDA-MB-231细胞，48 h后使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒分别测定海肾荧光素酶活性和萤火虫荧光素酶活性，计算相对荧光素酶活性，实验重复3次。

1.9 统计学方法

使用SPSS21.0软件进行统计学分析，采用单因素方差分析比较多组间差异，采用SNK-q检验分析比较两两组间差异，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-187在乳腺癌细胞中呈低表达

qRT-PCR检测结果显示，与人正常乳腺上皮细胞HBL-100（1.00±0.10）相比，乳腺癌MDA-MB-231、MDA-MB-453、MCF-7、SK-BR-3细 胞miR-187的 表 达 水 平［（0.11±0.01）、（0.26±0.02）、（0.42±0.04）、（0.34±0.03）］均显著下调（F=133.939，P＜0.05）。乳腺癌MDA-MB-231细胞中miR-187的表达水平最低，后续选取MDA-MB-231细胞用于转染实验。

2.2 转染miR-187 mimics对在MDA-MB-231细胞中miR-187和IGF-1R表达的影响

qRT-PCR检测结果显示，与miR-NC组和空白对照组相比，转染miR-187 mimics后MDA-MB-231细胞中miR-187的表达水平显著上调（t=22.293，22.497，均P＜0.01）。Western blotting检测结果显示，与miR-NC组和空白对照组相比，miR-187组MDA-MB-231细胞中IGF-1R蛋白表达水平明显下调（t=15.173，16.016，，均P＜0.01）。见图1和表1。

图1 Western blotting检测各组MDA-MB-231细胞中IGF-1R蛋白表达水平

表1 转染miR-187 mimics对MDA-MB-231细胞中miR-187和IGF-1R蛋白表达水平的影响/±s

2.3 过表达miR-187对MDA-MB-231细胞增殖能力的影响

MTT实验检测结果显示，与miR-NC组和空白对照组相比，miR-187组MDA-MB-231细胞OD值 显 著 降 低（t=11.941，11.023，均P＜0.01）。Western blotting检测结果显示，与miR-NC组和空白对照组相比，miR-187组MDA-MB-231细胞中PCNA蛋白表达水平明显下调（t=12.247，11.635，均P＜0.01）。见图2和表2。

图2 Western blotting检测各组MDA-MB-231细胞中PCNA蛋白表达水平

表2 过表达miR-187对MDA-MB-231细胞OD值及PCNA蛋白表达的影响/±s

2.4 过表达miR-187对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，与miR-NC组和空白对照组相比，miR-187组MDA-MB-231细胞凋亡率明显升高（t=15.414，15.013，均P＜0.01）。West‐ern blotting检测结果显示，与miR-NC组和空白对照组相比，miR-187组MDA-MB-231细胞中Cleaved Caspase-3蛋白表达水平明显上调（t=24.333，23.847，均P＜0.01）。见图3和表3。

A

2.5 miR-187对IGF-1R靶向调控关系验证

Tar‐getScan等生物信息学软件预测结果显示，miR-187与IGF-1R基因3’UTR存在靶向结合位点，如图4所示。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-187能够抑制野生型IGF-1R-Wt的相对荧光素酶活性（t=12.277，P=0.0003），而对突变型IGF-1R-Mut的相对荧光素酶活性无影响（t=0.408，P=0.704）。

表3 过表达miR-187对MDA-MB-231细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3蛋白表达水平的影响/±s

3 讨论

乳腺癌是女性癌症相关死亡率的主要原因，虽然乳腺癌的诊断和系统治疗方法已经取得进展，但患者的预后仍然很差。近年来，大量研究报道miRNA在癌症中表达失调，参与肿瘤的发展。基于miRNA数据和疾病的组织特异性，Liang等提出了一种名为miTS的新方法来预测乳腺癌的潜在治疗方法，表明miRNA在乳腺癌中起着至关重要的作用。证据表明，miR-187在人类多种恶性肿瘤中异常表达，且通过靶向不同基因参与肿瘤细胞生物学行为的调控。如Lin等研究，miR-187在宫颈癌组织和细胞系中表达下调，过表达miR-187可通过靶向HPV16 E6抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭，并促进细胞凋亡。在骨肉瘤中，miR-187在骨肉瘤临床组织样本及骨肉瘤细胞中的表达水平显著降低，上调miR-187可通过靶向MAPK12在体外抑制细胞生长和侵袭。另外有研究显示miR-187可发挥致癌基因的作用，如在非小细胞肺癌中，miR-187在非小细胞肺癌组织和细胞中表达上调，且其可通过靶向PTRF促进细胞上皮间质转化和迁移。Li等实验发现，miR-187在胃癌中呈高表达，体内和体外实验均证实了miR-187可通过抑制FOXA2促进胃癌的生长和转移。本实验结果显示，miR-187在乳腺癌细胞中呈低表达，提示其可能具有抑制乳腺癌发生和进展的作用。这与以往关于miR-187发挥抑癌基因作用的研究类似。

为进一步探究miR-187在乳腺癌中的作用，本实验选择miR-187表达水平最低的乳腺癌MDA-MB-231细胞转染miR-187 mimics，以探究过表达miR-187对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响。qRT-PCR检测结果显示，转染miR-187 mimics能够显著上调MDA-MB-231细胞中miR-187的表达。MTT实验表明，过表达miR-187可抑制MDA-MB-231细胞增殖能力。PCNA目前已被广泛认为是肿瘤细胞处于增殖状态的分子指标。本实验West‐ern blot实验结果显示，增殖细胞核抗原PCNA的表达水平明显降低。因此进一步证实了过表达miR-187可抑制MDA-MB-231细胞增殖。流式细胞术和Western blot检测结果显示，过表达miR-187能够提高细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白表达水平，表明过表达miR-187可促进乳腺癌细胞凋亡。此外，本实验发现，过表达miR-187后IGF-1R蛋白表达水平明显下降，提示miR-187参与调控乳腺癌细胞增殖和凋亡可能与抑制IGF-1R的表达有关。IGF-1R基因编码的蛋白是一种酪氨酸蛋白受体，在细胞转化、凋亡及有丝分裂等细胞生物学行为中发挥重要作用。最近研究显示，IGF-1R与乳腺癌中呈高表达，且与乳腺癌细胞增殖、凋亡等密切相关。本实验通过生物信息学及双荧光素酶报告基因验证了IGF-1R是miR-187的靶基因。表明过表达miR-187可通过靶向调控IGF-1R的表达抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖，促进细胞凋亡。

注：1—GAPDH;2—Cleaved Caspase-3;3—对照组；4—miR-NC;5—miR-187。

图4 miR-187与IGF-1R基因3’UTR存在靶向结合位点示意图

综上，本研究结果表明miR-187在乳腺癌细胞中呈低表达，且过表达miR-187可抑制乳腺癌MDAMB-231细胞增殖，促进细胞凋亡，该过程与靶向调控IGF-1R基因有关。miR-187和IGF-1R可能作为乳腺癌基因治疗的新靶点。