排碱渠水中产油微藻分离鉴定及培养产油

李艳宾，童 旭，蒋 卉，张 琴，汪慧玲

（1. 安徽工程大学生物与食品工程学院，芜湖 241000； 2. 塔里木大学生命科学学院，阿拉尔 843300）

0 引 言

新疆为典型干旱荒漠地区，也是中国盐碱化土壤集中分布区域，特别是南疆地区尤为严重，成为当地农业发展及资源利用的主要制约因素[1]。盐碱地治理改良有水利、化学、生物等多种措施[2-4]，但目前新疆地区主要农作物耕作中，盐碱化土壤改良仍以漫灌排水洗盐方式为主[5]。然而，大量漫灌排水洗盐排出的盐碱水经由排碱渠直接排放，不但造成水资源闲置浪费，也给周边土壤生态环境带来严重威胁[5]。排碱渠水体通常盐碱度高，营养匮乏，因此很少有利用微生物对排碱渠水进行资源化利用的相关研究。

微藻种类多样，广泛存在于自然界，是一类极具应用价值的可再生资源[6]。与其他能源作物相比，其具有光合效率高、生长迅速、不与粮争地、油脂含量高、环境适应能力强等优点[7-10]，因此被视为下一代生物质能源原料而备受各国学者关注[11]。微藻有光合自养、异养、兼养等多种营养模式[12]，既能只利用水和大气中CO2培养，又可利用环境废水中的少量养分进行异养或兼养生长[13]，能有效降低微藻培养的成本。因此，近年来利用荒漠和滩涂等不适于耕种的盐碱地进行产油微藻培养逐渐成为研究热点，并得到一些对氯化钠、碳酸氢钠、温度、强光等理化因子有良好耐受性的藻株[11,14-16]，但从排碱渠水中分离产油微藻并以排碱渠水为基质进行微藻培养尚未见报道。

微藻油脂含量受培养条件的影响，氮饥饿、高盐浓度、pH值变化等胁迫条件能有效提高微藻油脂产量[17]，加之其独特的营养模式，为微藻有效利用排碱渠水生长产油提供了可能。因此，筛选适应能力强、油脂产量高的微藻，并利用排碱渠水进行培养，对提高排碱渠水资源的利用价值、降低环境风险具有重要的意义。本研究以一株从新疆阿拉尔市垦区排碱渠水体中分离获得的产油微藻为研究对象，对其在以排碱渠水为基质的培养液中的生长和油脂积累特性进行了分析，建立了相关的动力学模型，同时考察了该藻株的盐耐受性和在半连续培养模式下的生长与产油稳定性，以期为实现排碱渠水的资源化利用提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 排碱渠水样采集及水质分析

本研究分离微藻及配制培养液所用排碱渠水样取自新疆阿拉尔市垦区，渠道两边农田作物主要为棉花。经测定该排碱渠水pH值为7.63，水中主要元素成分质量浓度为（mg/L）：总有机碳30.0、总氮35.0、总磷0.086、Na+2 638.8、K+92.3、Ca2+168.9、Mg2+453.5、Fe3+0.65、Cu2+0.05、Pb2+0.35。可见该水样Na+浓度高且有机C、N、P含量低，兼具高盐和寡营养的特点，生物可利用性较差。但对环境适应性强的微藻来说，筛选到有较强盐耐受性的产油藻株，并适当补充N、P等必要的营养元素，即可有效利用排碱渠水生长产油。在混合营养条件下，微藻可同时利用光和有机碳生长[18]。随着细胞密度增加，微藻存在光照受限的问题[19]，而添加适量有机碳源可促进微藻生长，提高生物量[20-21]。有研究表明，小球藻、斜绿藻等微藻可以利用葡萄糖等有机质作为碳源快速生长[20,22]，因此，在利用排碱渠水培养微藻时可考虑添加一定量的葡萄糖，以促进微藻生长与产油。

1.2 培养基

微藻分离纯化及藻种活化采用本实验室改良的BG11培养基[23]。

根据水质分析，设计排碱渠水培养基为：葡萄糖（用量根据试验设计确定），KNO30.5 g，KH2PO40.7 g，K2HPO40.3 g，FeSO4·7H2O 0.05 g，排碱渠水1 L，115 ℃灭菌20 min。

1.3 主要仪器设备

荧光显微镜，日本奥林巴斯；超声波细胞破碎仪，西安比朗生物科技有限公司；离心机，上海菲恰尔分析仪器有限公司；光照培养箱，浙江托普仪器有限公司；钠离子计，上海仪电科学仪器股份有限公司；UV-1100B紫外分光光度计，上海精密仪器仪表有限公司。

1.4 试验方法

1.4.1 产油微藻分离筛选

排碱渠水用浮游生物网（25#）浓缩收集，水样离心处理（6 000 r/min、10 min）后取沉淀于液体培养基中富集培养3 d，然后取100μL于固体培养基上涂布分离，并挑取单藻反复划线分离纯化，直至镜检得到纯藻株。微藻培养条件为温度（28±1）℃，光照强度5 000 lx，光/暗周期14 h∶10 h。液体培养时每天震荡混匀1次。

挑取培养6 d的微藻细胞，悬浮于生理盐水中，用尼罗红染色法进行细胞油脂检测，以此筛选出高产油脂藻株。染色方法沿用本实验室前期所用方法[23]，主要步骤为：200μL藻悬液，加入3μL尼罗红染料、75μL DMSO（二甲基亚砜），混匀，于40 ℃恒温处理10 min，离心（6 000 r/min、10 min）去掉上清液，再用无菌生理盐水反复混匀、离心4次，荧光显微镜下观察细胞荧光强弱。

1.4.2 产油微藻鉴定[23]

取对数期藻液，离心后取100 mg藻泥用液氮研磨，使用EasyPureTM Plant Genomic DNA Kit（北京全式金生物技术有限公司）提取微藻总DNA，用ITS1/ITS4通用引物（ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）PCR扩增后，由上海生工生物工程有限公司测序。测序序列在GenBank进行Blast比对分析，并采用MEGA6.05构建进化树。

1.4.3 添加不同浓度碳源对微藻生长及产油的影响

配制排碱渠水培养基，按每瓶30 mL分装至150 mL玻璃瓶，设置葡萄糖0、1.25、2.50、3.75、5.00 g/L 5个处理，每处理3次重复。藻种活化培养至对数期，以10%接种量接种于排碱渠水培养基中培养，每天振荡摇匀藻液1次，每2 d测定微藻生物量、油脂含量与产量。

油脂提取采用氯仿甲醇法[23]。按每1 g鲜藻体加入4 mol/L盐酸10 mL，混匀后室温放置一定时间，再沸水浴3～5 min，立即转移至-20 ℃迅速冷却。冷却后加入甲醇10 mL，振荡2 min，再加入氯仿10 mL振荡混合。离心后收集氯仿层，加入等体积0.15%氯化钠溶液，混匀，再次离心，用接收瓶收集氯仿层溶液，旋蒸仪除去氯仿后放置80 ℃烘箱烘至质量恒定，称量。另取等体积藻液离心，收集藻体烘干称量微藻干质量。按以下公式计算微藻生物量及油脂产量

1.4.4 微藻生长及产油动力学模型分析

根据1.4.3试验结果，分别用Logistic模型、Gaden生长相关模型[24]对微藻生长动力学和油脂生成动力学进行分析，确定模型参数，以此探求微藻生长、油脂生产与培养基中碳源添加浓度及培养时间之间的关系，为后期实现排碱渠水高效培养产油微藻的工艺优化、控制奠定基础。

Logistic模型方程为

式中X为微藻生物量，g/L；X0为微藻接种生物量，g/L；Xmax为微藻最大生物量，g/L；μm为最大比生长速率，d-1，t为时间，d。

Gaden模型方程为

式中P为微藻油脂产量，g/L；Yp/x为基于微藻生物量的油脂得率，g/g；P0为接种初始油脂产量，g/L。

1.4.5 微藻盐耐受性分析

配制2.50 g/L葡萄糖的排碱渠水培养基，添加不同量NaCl使培养基中Na+分别为5、10、15、20 g/L，另设不加NaCl的排碱渠水原液处理，按1.4.3所述方法接种微藻培养。每处理3次重复，培养10 d后测定微藻生物量和油脂产量。

1.4.6 排碱渠水半连续培养微藻的稳定性试验

配制2.50 g/L葡萄糖的排碱渠水培养基，按1.4.3所述方法接种微藻。培养10 d后取样测定生物量与油脂产量，同时培养瓶中余留3 mL藻液，加入27 mL新鲜培养基继续培养，10 d后再次测定生物量与油脂产量，并补充新鲜培养基培养，如此3个周期（分别记为T1、T2、T3）。排碱渠水浓缩2倍后配制新鲜培养基，补充至T3周期余留的藻液中继续培养3个周期（分别记为TC1、TC2、TC3），以此检验微藻在半连续培养条件下的生长与产油稳定性。

1.5 数据分析

采用Excel 2010和SPSS18.0软件进行数据统计分析，用Origin8.5软件进行图表绘制和动力学模型拟合。

2 结果与分析

2.1 排碱渠水中产油微藻分离与鉴定

共从排碱渠水中分离得到8株藻株，根据《中国淡水藻类—系统、分类及生态》和《中国常见淡水浮游藻类图谱》对比藻株显微形态，初步判定该8株藻均为绿藻。尼罗红染色结果发现，有5株藻（编号分别为WY202、WY204、WY205、WY206、WY207）能观察到明显的红色荧光，其中WY205的荧光相对最强烈（图1），表明其胞内油脂含量最高，因此选择藻株WY205开展后续研究。

提取对数期的微藻WY205基因组DNA，PCR扩增其ITS序列并测序，从GenBank挑选部分微藻序列与所得序列进行Blast比对，并构建系统发育树（图2）。结果显示，WY205与Chlorellasp. Rys（MH010858）、Chlorella sorokinianaEAKI（MH220049）高度相似（＞99%），其中与Chlorellasp. Rys（MH010858）的部分片段相似度达99.72%。因此，经分子生物学鉴定该藻属于小球藻，将其命名为Chlorellasp. WY205，GenBank登录号MT921587。

2.2 添加不同浓度碳源对微藻WY205生长与产油的影响

根据排碱渠水水质特点（表1），在5 g/L范围内考察了添加不同浓度葡萄糖对微藻WY205生长与产油的影响，结果如图3所示。从图3a可以看出，相比未添加葡萄糖的处理（0 g/L），排碱渠水培养基中添加不同浓度葡萄糖，均能有效促进微藻生长。在0～4 d，不添加葡萄糖处理中微藻的生物量增加相对缓慢，可视为延滞期，此后4～8 d期间进入对数期，而后8～14 d到达稳定期。添加葡萄糖各处理微藻的生长趋势与之相似，但普遍延滞期不明显，自第2天起微藻生物量即迅速增加进入对数期，至第8天时生长趋于平缓。以上说明补充适量有机碳源能够增强微藻的环境适应能力，缩短延滞期，提高生长速率，这与已有的类似研究结论一致[20-21]。

有报道高浓度有机碳也有可能对微藻生长造成抑制[25]，此外，增加碳供应将提高废水中的碳氮比，达到一定限度后，碳源的供给将不再成为微藻生长的限制因素，取而代之的或是氮源浓度等其他因素的影响[20]。从本研究结果来看（图3a），在2.50 g/L葡萄糖添加范围内，微藻的生长随着糖浓度增加而增加，但添加3.75、5.00 g/L葡萄糖时，微藻生物量不再显著增长，甚至在到达稳定期前有较大幅度的降低。

图3b为不同葡萄糖浓度下微藻WY205的油脂产量变化情况。图中显示，各处理微藻油脂产量的变化趋势与其生长趋势大体相同，补充有机碳源有效提高了微藻的油脂产量，均显著高于不加糖处理。对比图3a和3b来看，各处理微藻油脂积累与细胞生长基本同步，这与其它类似研究报道结果相同[26-27]。由此可推断，该微藻油脂合成过程属于生长偶联型。其中添加2.50 g/L葡萄糖处理的油脂产量最高，在培养10 d时测得油脂产量为1.20 g/L，此时胞内油脂含量40.18%。而糖浓度大于或小于2.50 g/L，油脂产量均有所降低。

大量研究表明，微藻具有较好的去除废水中营养物及微量元素的能力[28-29]。Bohutskyi等[30]发现，在小球藻异养培养阶段，培养基质中氮迅速消耗，且Cu、Mg、Fe等微量元素去除率达到87%～99%。此外，在较高盐浓度环境下，一些微藻还具有清除Na+等盐离子的能力[31-32]。本研究在添加2.50 g/L葡萄糖处理培养结束后，对培养液中的主要化学元素进行了分析，结果显示，培养液中C、N、P等主要营养元素消耗较大，利用率均在88%以上（表 1），说明排碱渠水培养基中的营养成分可被微藻有效利用。其余金属离子浓度绝大部分有不同程度的降低，特别是Na+浓度从2 638.8降为2 174.9 mg/L，降幅17.6%，表明微藻WY205可利用或富集部分Na+等离子，表现出一定的清除水中盐离子的能力。

表1 添加2.5 g·L-1葡萄糖处理培养前后培养液中化学元素分析Table 1 Analysis of chemical elements in the liquid medium in pre- and post-culture treated with addition of 2.5 g·L-1 glucose

2.3 微藻WY205的生长与产油动力学分析

为更好地探讨微藻WY205的生长与产油过程规律，以助于实现排碱渠水高效培养微藻产油过程的预测和控制，根据图3试验结果，对不同处理微藻的生长和油脂生成过程分别用Logistic方程和Gaden生长相关模型方程[24]进行动力学拟合，并求解出相应的动力学参数，结果如表2所示。

表2 不同葡萄糖浓度处理中微藻WY205生长与产油的动力学模型参数值Table 2 Dynamical parameters of growth and lipid production of microalga WY205 treated with different glucose concentrations

由表2可知，Logistic模型能够较好地描述微藻WY205在排碱渠水中的生长情况，曲线拟合R2值基本都在0.9以上（3.75 g/L葡萄糖处理为0.898 6）。所有添加葡萄糖处理的Xmax值均大于不加糖处理，2.50 g/L、5.00 g/L糖浓度处理的μmax值大于不加糖处理，也再次说明补充适量有机碳源能够促进排碱渠水中微藻的生长。其中添加2.50 g/L葡萄糖，其μmax、Xmax预测分别达到0.61 d-1、3.03 g/L，分别是不加糖处理的1.05倍、1.35倍。

Gaden生长相关模型同样能较好描述微藻WY205的油脂生成情况。从表中可见，加糖的各处理，其基于生物量的油脂得率Yp/x均要高于不加糖处理，其中添加2.50 g/L葡萄糖处理的Yp/x达到0.42 g/g，也即每增加1 g的微藻生物量，有0.42 g的油脂生成，据此得到该处理的最大油脂产量为1.26 g/L，是不加糖处理的2.21倍。

综上分析，排碱渠水培养微藻WY205的最适葡萄糖添加浓度为2.50 g/L，后续研究选择此糖浓度进行。

2.4 微藻WY205盐耐受性分析

盐胁迫通常作为促进微藻积累油脂的有效手段之一[17,33]。由于Na+是研究所用排碱渠水的主要盐离子，浓度约为2.64 g/L，为探明微藻WY205的盐适应性，考察了在2.64（排碱渠水原液）、5、10、15、20 g/L的Na+浓度下该藻的生长产油情况，结果见图4。

从图4可以看出，随着Na+浓度增加，微藻生物量呈逐步下降趋势（P＜0.01）。当Na+浓度达15 g/L以上时，微藻生物量几乎没有增加，此时折合NaCl的浓度约为38.15 g/L，说明高于此盐浓度，微藻的生长产油过程将受到严重抑制。另一方面，一定程度盐胁迫增强了微藻油脂合成能力，其中Na+浓度为5 g/L时（折合NaCl 12.72 g/L），微藻胞内油脂含量达44.90%，油脂产量达到最高，比排碱渠水原液处理（Na+浓度2.64 g/L）中的油脂产量提高了21.69%。继续增加Na+浓度至10 g/L（折合NaCl 25.43 g/L），微藻胞内油脂含量达到59.71%，但由于生物量的大幅降低，油脂产量也开始降低，然而相对排碱渠水原液处理，油脂产量依然高出10.84%，表现出微藻WY205具有良好的盐耐受能力。

2.5 排碱渠水半连续培养微藻WY205的稳定性试验

为探讨利用排碱渠水持续培养微藻的可行性，检验了微藻WY205在排碱渠水中半连续培养的生长与产油稳定性。考虑到荒漠地区水分蒸发快的因素，设置了排碱渠水原液培养3个周期后，再以排碱渠水2倍浓缩液培养3个周期的模式，结果如图5所示。

从图5a可以看出，T1～T3处理（分别为3个原液培养周期）的微藻生物量总体要略高于TC1～TC3处理（分别为3个浓缩排碱渠水培养周期），T3处理的生物量为最高。从T3转到TC1，由于培养环境的改变，特别是排碱渠水中Na+浓度增高，导致微藻生物量有较为明显的降低，但一定范围内Na+浓度的增加反而有利于胞内油脂积累，此条件下微藻胞内油脂含量达到48.93%，为所有培养周期中最高，因此TC1处理获得了最大的油脂产量（图 5b），这对因蒸发量大而有盐碱持续加重现象的排碱渠水等荒漠水体的资源利用方面具有独特的优势。而从TC1到TC3，微藻生物量有逐步增大的趋势，说明该藻能较好的适应新环境。

本研究共进行了6个周期共60 d的微藻培养，经方差分析，每周期微藻的生物量与油脂产量变化均无显著性差异，微藻胞内油脂含量均在30%以上，说明微藻WY205在排碱渠水中具有良好的生长与产油稳定性，也初步验证该藻利用排碱渠水持续生长产油具有可行性，可为排碱渠水的资源化利用提供参考。但需要注意的是，从T1到T3、TC1到TC3，油脂产量均有逐步下降的趋势（图5b），因此随着培养周期的进一步增加，微藻油脂产量是否会有更大幅度的降低，还需今后进一步研究验证。

3 结 论

1）从排碱渠水中分离得到一株油脂含量高的微藻WY205，经分子鉴定为小球藻Chlorellasp.。该藻株具有自养和异（兼）养能力，在以排碱渠水为培养基时，补充适量有机碳源可缩短其延滞期，提高生长速率和油脂产量。对微藻的生长和产油过程动力学进行了分析，分别建立了Logistic方程和Gaden生长相关模型方程，可较好地描述微藻WY205在排碱渠水中的生长与产油过程。经分析，排碱渠水培养基中葡萄糖的最适添加浓度为2.50 g/L。

2）微藻WY205具有较高的盐耐受能力，培养基中Na+浓度添加至5 g/L（约合NaCl 12.72 g/L）时可获得最高油脂产量，比排碱渠水原液（Na+浓度2.64 g/L）处理提高了21.69%。添加Na+浓度至10 g/L（约合NaCl 25.43 g/L），虽然微藻生物量及油脂产量均开始降低，但比排碱渠水原液处理的油脂产量依然高出10.84%。

3）在3个周期排碱渠原液加上3个周期排碱渠水2倍浓缩液的半连续培养中，微藻WY205表现出较好的适应性和稳定性，每个周期的生物量与油脂产量变化不显著，说明利用排碱渠水持续培养产油微藻具有可行性。后续研究可对该微藻的培养条件做进一步优化，并扩大培养规模进行检验。