Wnt/β-catenin抑制剂XAV939对心肌梗死大鼠心肌纤维化的影响

张 翥，陶亮亮，刘品刚，范修才

（南通大学附属建湖医院心内科，江苏南通 224700）

心肌梗死（myocardial infarction，MI）发生后，心脏局部发生缺血导致大量的心肌细胞坏死［1］。当MI损伤后心肌细胞无法被修复时，会伴随充血水肿，同时有大量炎症细胞浸润和心肌细胞的坏死，这些坏死的细胞会由胶原成分替代，导致心肌纤维化、严重的心力衰竭和死亡［2］。因此，减少心肌纤维化能够改善MI发生率，同时保护心肌功能。刘宇等［3］研究表明，Wnt/β-catenin信号通路与心肌梗死后出现心肌损伤关系密切。XAV939是一种Wnt/β-catenin信号通路，可以通过抑制端锚聚合酶活性来稳定结构从而维持死亡复合体的完整，最终导致被降解，实现特异性抑制Wnt/β-catenin信号通路［4］。由此，本研究推测通过使用Wnt/β-catenin信号通路抑制剂可能会对大鼠MI后心肌纤维化并心脏功能有一定的影响。本研究观察了Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV939对MI大鼠心肌纤维化的影响，以期为MI的治疗奠定一定的理论依据。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 实验动物 无特定病原体（SPF）级3周龄SD大鼠60只，购自南通大学动物实验中心，所有大鼠均在本院动物中心实验室饲养，本实验经过动物伦理委员会批准同意。

1.1.2 药物与试剂 XAV939（纯度：99.49%）购自AbMole中国分公司；苏木素、伊红购自武汉博士得生物有限公司；中性福尔马林、酒精、二甲苯购自天津科密欧有限公司；转化生长因子-β1（trans⁃forming growth factor β1，TGF-β1）抗体（货号：sc- 130348；批号：20191203）、基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMP）-9抗体（货号：sc- 393859；批号：20190903）、β-catenin抗体（货号：sc-7963；批号：20191003）均购自Santa Cruz公司；HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗购自美国Thermo公司。

1.1.3 仪 器 小动物彩色多普勒超声仪（型号：Vivid i）购自北京迈润医疗器械有限公司；电子天平（型号：BS-124s）购自北京赛多斯仪器系统有限公司；温离心机购自湖南恒诺离心机有限公司；正置型金相显微镜（型号：SG-51）购自上海光学仪器厂；蛋白电泳及转膜仪、凝胶成像系统购于以色列DNR公司；实验室切片机（型号：LD-66）购自长沙益广制药机械公司。

1.2 方 法

1.2.1 分组及建立模型 将60只大鼠适应性喂养1周，采用随机数字表法分为假手术组、模型组和抑制剂组，每组20只。除假手术组外各组采用结扎左冠状动脉前降支，制成心肌梗死大鼠模型，制作方法具体操作如下：腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，胸骨左缘第3至4肋间开胸，使用5-0丝线结扎左冠状动脉前降支。结扎后左心室前壁变苍白并运动减弱后迅速将心脏放回胸腔，逐层关胸。术后将大鼠连接心电图，若大鼠出现V1～V6段明显抬高则证实结扎成功。造模过程中6只大鼠死亡，大鼠死亡率为15.00%，34只存活，造模成功30只，造模成功率为75.00%。

1.2.2 药物干预 将给药日作为第0天开始算起，自第10天起抑制剂组每天腹腔注射100 μL，浓度为2 mg/mL的XAV939溶液，每天注射1次，连续注射7 d，假手术组和模型组注射等量0.9%氯化钠溶液。

1.3 检测项目

1.3.1 大鼠心脏功能检测 完成药物干预后1周，所有大鼠使用戊巴比妥钠麻醉，使用小动物彩色多普勒超声仪测定大鼠左心室收缩末期内径（left ventricular end systolic diameter，LVESd）、左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDd）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室短轴缩短率（left ventricu⁃lar fractional shortening，LVFS）。

1.3.2 心肌梗死面积检测 完成大鼠心脏功能检测后采用颈椎脱臼法处死大鼠，取出心脏，放入OTC中固定，取心肌组织染色并拍照，使用Image pro plus 6.0图像分析软件根据数码照片中的标尺进行长度定标，测量4片心肌的左心室梗死区和非梗死区面积并求和，然后计算梗死区占左心室心肌总面积。

1.3.3 大鼠心肌胶原浓度 心肌羟脯氨酸浓度为心肌胶原浓度［5］，使用氯胺T法测定羟脯氨酸浓度，取没使用HCL的大鼠心肌组织在125℃酸解5 h，使用氢氧化钠中和pH值至7，离心机中2 000 r/min离心10 min，加入0.05 mmol/L的氯胺T 1 mL混匀5 min后加入二氨苯甲醛1 mL，80℃水浴后使用分光光度计在560 nm处比色，使用羟脯氨酸标准品按上述相同步骤制作标准曲线，根据标准曲线求出羟脯氨酸浓度，羟脯氨酸浓度×7.64为心肌胶原浓度。

1.3.4 心肌细胞凋亡检测 取各组大鼠心脏组织切片，采用TUNEL染色，按照试剂盒说明要求操作，在400倍光学显微镜下观察结果，随机选取5个视野计算凋亡细胞数目。凋亡率（%）=阳性细胞/总细胞×100%。

1.3.5 Western blot检测蛋白表达水平 取各组大鼠心脏组织切片，用剪刀剪碎后使用胰蛋白酶消化，使用10 %十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法提取总蛋白，使用半干法将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜，置于5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加入各需要检测蛋白的一抗、二抗，孵育2 h，以GADPH为内参蛋白，采用显色液显色后行吸光度分析，计算各蛋白相对表达量。

1.4 统计学分析

本研究数据分析采用软件为SPSS 22.0，本研究作图采用软件为GraphPad Prism5。数据以（）表示，多组间比较使用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法；若P＜0.05则表明数据差异有统计学意义，本研究所有检验均为双侧检验。

2 结果

2.1 各组大鼠心脏功能检测结果比较

检测大鼠心脏功能发现，相比假手术组，模型组大鼠LVESd、LVEDd显著升高，LVEF、LVFS显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；相比模型组，抑制剂大鼠LVESd、LVEDd显著降低，LVEF、LVFS显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠心脏功能检测结果比较 ［］

表1 各组大鼠心脏功能检测结果比较 ［］

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，1）*P＜0.05

2.2 各组大鼠心肌梗死面积及胶原浓度检测结果比较

相比假手术组，模型组大鼠羟脯氨酸浓度、胶原浓度和心肌梗死面积均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；相比模型组，抑制剂大鼠羟脯氨酸浓度、胶原浓度和心肌梗死面积均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠心肌梗死面积及胶原浓度检测结果比较 ［］

表2 各组大鼠心肌梗死面积及胶原浓度检测结果比较 ［］

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，1）*P＜0.05

2.3 各组大鼠TUNNEL染色观察心肌细胞凋亡情况比较

使用TUNNEL染色观察心肌细胞凋亡情况发现，假手术组大鼠心肌细胞凋亡率为（10.02±2.36）%，显著低于模型组大鼠心肌细胞凋亡率（49.36±9.32）%，差异有统计学意义（P＜0.05）；相比模型组，抑制剂组心肌细胞凋亡率［（22.01±8.32）%］显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1。

图1 各组大鼠TUNNEL染色观察心肌细胞凋亡情况的组织学图片（×400；A为假手术组；B为模型组；C为抑制剂组）

2.4大鼠心肌组织促心肌纤维化因子及Wnt/βcatenin信号通路相关蛋白表达检测结果

由蛋白质印迹实验检测相关蛋白相对表达的结果可以看出，相比假手术组，模型组大鼠心肌组织TGF-β1蛋白相对表达、MMP-9蛋白相对表达、β-catenin蛋白相对表达均显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；相比模型组，抑制剂组TGF-β1蛋白相对表达、MMP-9蛋白相对表达、β-catenin蛋白相对表达均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2和表3。

图2 各组大鼠促心肌纤维化因子及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达检测结果比较（A为假手术组；B为模型组；C为抑制剂组）

表3 各组大鼠促心肌纤维化因子及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白相对表达情况 ［］

表3 各组大鼠促心肌纤维化因子及Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白相对表达情况 ［］

注：与假手术组相比，*P＜0.05；与模型组相比，1）*P＜0.05

3 讨论

心脏是人体核心器官之一，当其受到损伤后会引起一系列指标的改变［6］，LVSP是心脏向动脉射血的主要动力，在心脏舒张时内压降低，腔静脉血压回流入心脏，心脏每收缩和舒张一次构成一个心动周期［7］。发生MI后心肌细胞会死亡，并形成瘢痕导致心肌病理重构，当心肌细胞死亡后瘢痕组织和结缔组织会增生导致严重的心室收缩和舒张功能不全，使得心肌能力减退［8］。LVEF、LVFS、LVESd和LVEDd为常见的评价心功能的指标。本研究发现，相比模型组，抑制剂组大鼠LVESd、LVEDd显著降低，LVEF、LVFS显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明使用Wnt/βcatenin信号通路抑制剂XAV939作用后大鼠心功能得到了显著的改善。为了进一步深入研究使用抑制剂XAV939与心肌梗死后心肌纤维化的关系，本研究在后续检测了纤维化相关指标及心肌梗死面积。

心肌细胞通过分泌介质促进增殖、循环系统中纤维细胞归巢、上皮细胞向间质细胞转化，从而形成纤维母细胞、肌成纤维细胞灶［9］。这种细胞灶能够分泌大量以胶原蛋白为主的细胞外基质，因此在心肌纤维化过程中会产生大量的胶原蛋白，检测胶原浓度可以反映心肌纤维化的进程［10］。本研究发现，相比模型组，抑制剂组大鼠羟脯氨酸浓度、胶原浓度和心肌梗死面积均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明使用抑制剂XAV939后大鼠心肌成纤维细胞显著减少，使得其分泌的胶原蛋白也减少，有效抑制了大鼠心肌纤维化过程。

心肌纤维化是成纤维细胞异常增殖形成瘢痕组织，这个过程与心肌成纤维化因子有着密切关系［11］。TGF-β1是一种常见的促有丝分裂因子，可以刺激心肌成纤维细胞增殖并过度合成细胞外基质，同时抑制胶原酶的降解，导致心肌纤维化［12］。除了TGF-β1，MMP也是一组能特异地降解细胞外基质成分的蛋白，在心肌组织重构中起重要作用，其中MMP-9在心肌纤维化的发展过程中起重要作用［13］。本研究蛋白质印迹实验结果发现，相比模型组，抑制剂组TGF-β1蛋白相对表达、MMP-9蛋白相对表达、β-catenin蛋白相对表达均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明使用了XAV939后大鼠心肌促有丝分裂的因子和降解细胞外基质成分均显著降低。这可能和XAV939抑制了Wnt/β-catenin信号通路，使得其下游的成纤维细胞因子分泌得到了有效的抑制有关。付舒等［14］研究表明：降低心肌组织中MMP-9及TGF-β1的表达可以有效缓解心肌纤维化进展，与本研究得出的结论相一致。

Wnt/β-catenin信号通路是一种经典信号通路，在细胞增殖、细胞极性及分化等细胞活动中有着直接的作用［15］。Wnt信号通路活性的激活可能会促进心肌损伤过程，并激活邻近的肌成纤维细胞，当成纤维细胞被激活后，心肌纤维化则会加速［16］。同时激活Wnt/β-catenin信号通路会促进其下游的靶基因MMP-9和周期蛋白D1过表达，加速纤维化进程。邓文超等［17］研究表明，Wnt/β-catenin信号途径及TGF-β1存在交叉，并可能通过相互作用在纤维化的发生与进展过程中起到协同作用。本研究发现，相比模型组，抑制剂组β-catenin蛋白相对表达均显著降低。说明Wnt/β-catenin信号通路抑制剂XAV939可以通过抑制β-catenin蛋白的表达，实现抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，防止产生过多的成纤维细胞因子，保护心肌组织、防止心肌纤维化。陶静等［18］研究表明，抑制Wnt/β-catenin信号通路可以抑制心肌成纤维细胞增殖、胶原合成从而缓解心肌纤维化的进展。

综上所述，AV939通过抑制Wnt/β-catenin信号通路降低大鼠心肌组织中促纤维化因子的表达及胶原的浓度并抑制心肌细胞凋亡，实现防止心肌梗死后心肌纤维化的发生与发展。