替罗非班通过磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路对氧糖剥夺心肌细胞的干预作用△

李 冰，段宏宇，李玉梅，郝一鸣

（内蒙古包钢医院心血管内科，内蒙古包头 014010）

心肌梗死是由于心脏冠状动脉等主要血管堵塞或狭窄导致的心肌组织缺血、低氧、营养物质供应不足、代谢产物清除减少，从而造成心肌细胞凋亡、心肌组织坏死的心血管疾病［1-3］。而心肌梗死最有效的治疗方法是修复心肌梗死后心肌组织，改善其循环作用［4］。替罗非班是一种重要的血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa抑制剂，能够有效强化抗血小板治疗，改善冠状动脉血流和心肌灌注，显著降低手术治疗后的主要不良心血管事件的发生率。本研究构建氧糖剥夺（oxygen-glucose deprivation，OGD）心肌细胞损伤模型，通过测定胞外炎症水平及过氧化物水平，观察替罗非班对损伤心肌细胞的修复效果及氧化应激信号蛋白磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的变化，初步探索替罗非班对受损心肌细胞功能修复的作用机制。

1 材料和方法

1.1 主要试剂

大鼠心肌细胞H9C2购自中国科学院细胞库；替罗非班购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；LY294002抑制剂购自APExBIO；活性氧（reac⁃tive oxygen species，ROS）检测试剂盒购自Beyotime；乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）测定试剂盒购自南京建成；磷酸化（phosphorylation，p）-AKT兔抗购自Abcam（Ab38449，稀释比例为1∶1 000）；兔抗鼠PI3K购自Abcam（Ab191606，稀释比例为1∶1 000）；兔抗鼠p-PI3K购自Abcam（Ab182651，稀释比例为1∶1 000）；兔抗鼠p-AKT购自Abcam（Ab38449，稀释比例为1∶1 000）；丙二醛（malondi⁃aldehyde，MDA）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-6、心房利钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒购自Bioswamp；兔抗鼠AKT购自Bioswamp（PAB34089，稀释比例为1∶1 000）；山羊抗兔IgG羊抗购自Bioswamp（SAB43711，稀释比例为1∶10 000）。

1.2 氧糖剥夺造模

收集H9C2细胞，分布于6孔板中，5×105个/孔，每孔2 mL，用DMEM正常条件培养24 h，使细胞贴壁。采用含2%胎牛血清的DMEM无糖培养基，在37℃，5%二氧化碳+95%氮气的培养箱中继续培养15 h。按照LDH测定试剂盒说明书进行检测细胞上清液LDH活性，评估OGD模型。

1.3 MTT法筛选替罗非班处理浓度及时间

收集OGD细胞模型，调整细胞密度，分布于96孔板中，5×103个/孔，每孔100 μL。待细胞培养至贴壁后，分别加入1、10、100、1 000 nmol/L替罗非班，培养24、48 h。每孔加入10 μL MTT溶液，继续培养4 h。去上清，加入150 μL二甲基亚砜，低速振荡10 min。酶标仪检测490 nm处吸光值。

1.4 细胞分组与处理

将H9C2细胞分为正常组、模型组、替罗非班组、抑制剂组、替罗非班+抑制剂组。除正常组采用正常DMEM培养外，其他组细胞均进行OGD模型构建，替罗非班组加入100 nmol/L替罗非班；抑制剂组加入5 μmol/L的PI3K抑制剂LY 294002；替罗非班+抑制剂组加入5 μmol/L的LY294002和100 nmol/L替罗非班。

1.5 酶联免疫吸附试验检测方法

收集各组细胞上清液2 mL，5 000 r/min离心5 min，取上清进行ELISA检测。根据试剂盒的说明书稀释标准品，绘制标准曲线。在酶标包被板上待测样品孔中先加细胞上清液40 μL，再加生物素标记的抗体10 μL，加入酶标试剂50 μL。用封板膜封板后置37℃温育30 min。弃去液体，每孔加入显色剂A和B各50 μL，37℃避光显色10 min。每孔加入终止液50 μL，终止反应。酶标仪检测540 nm吸光值，代入标准曲线的回归方程式，分别计算细胞上清液中MDA、TNF-α、IL-6、ANP和BNP浓度。

1.6 流式检测细胞活性氧水平

将细胞接种于6孔板，按照说明书配置终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA，待测细胞处置好后，去上清，加入稀释好的DCFH-DA使细胞能被充分盖住为宜，细胞培养箱内孵育20 min。无血清培养液洗涤细胞3次，洗掉黏附在细胞表面的DCFH-DA。利用流式仪进行检测，平均荧光强度则可表示ROS水平的高低。

1.7 Western blot检测细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的表达水平

冰面上RIPA蛋白裂解液裂解细胞，每5 min振荡1次，裂解20 min，4 ℃下15 000 r/min离心30 min，吸取上清液获取总蛋白。根据二辛可酸（BCA）蛋白定量结果上样，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离2.5 h，转膜后，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，4℃下分别孵育p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT一抗过夜，PBST洗10 min，重复3次。室温孵育二抗1 h，PBST洗10 min，重复3次，曝光显影。采用BIO-RAD Image Lab软件进行灰度值分析。

1.8 统计学分析

所有数据均采用统计软件SPSS 22.0进行分析处理。计量资料以（）的形式表示，两组间比较采用t检验，多组间数据比较选择单因素方差分析，两两比较采用q检验。以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 氧糖剥夺模型评估

和正常组比较，OGD模型组细胞LDH释放量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），说明OGD模型组细胞出现损伤，见图1。

图1 细胞上清液LDH浓度比较

2.2 替罗非班处理浓度及时间筛选结果

MTT结果显示，在一定范围内，替罗非班浓度越高，OGD模型细胞活性越大，且24 h比48 h的促进效果更佳，但当替罗非班浓度大于100 nmol/L后，细胞增殖速度开始减慢，见图2。因此，选择100 nmol/L，作用时间为24 h为最终实验中替罗非班的处理浓度及时间。

图2 MTT检测替罗非班对OGD心肌细胞增殖的影响

2.3 替罗非班对氧糖剥夺心肌细胞活性氧水平的影响

DCFH-DA荧光强度表示细胞ROS水平，和正常组比较，模型组含高水平ROS细胞比例显著增多，差异有统计学意义（P＜0.05）；和模型组比较，替罗非班组、抑制剂组、替罗非班+抑制剂组含高水平ROS细胞比例显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；和抑制剂组比较，替罗非班+抑制剂组含高水平ROS细胞比例显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图3。

图3 各组流式细胞检测细胞ROS水平比较

2.4 替罗非班对氧糖剥夺心肌细胞炎症因子的影响

和正常组比较，模型组细胞MDA、TNF-α、IL-6、ANP、BNP浓度显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；和模型组比较，替罗非班组、抑制剂组、替罗非班+抑制剂组的MDA、TNF-α、IL-6、ANP、BNP浓度显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；和抑制剂组比较，替罗非班+抑制剂组的MDA、TNF-α、IL-6、ANP、BNP浓度显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），详见表1。

表1 各组心肌细胞炎症因子浓度比较 ［］

表1 各组心肌细胞炎症因子浓度比较 ［］

注：与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，1）*P＜0.05；与抑制剂组比较，2）*P＜0.05

2.5 Western blot检测p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的表达结果

和正常组比较，模型组p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；和模型组比较，替罗非班组、替罗非班+抑制剂组的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；和抑制剂组比较，替罗非班+抑制剂组的p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的表达水平显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图4。

图4 各组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT的表达的比较（1=正常组、2=模型组、3=替罗非班组、4=抑制剂组、5=替罗非班+抑制剂组）

3 讨论

超氧化物歧化酶是机体内重要的清除ROS自由基的一类因子，是细胞抗氧化功能的重要保障。氧化应激可诱导心血管功能异常，引发动脉粥样硬化和心肌梗死等心血管疾病［5-6］。机体中ROS的产生和清除平衡被打破，则会致机体氧化还原作用失衡，从而产生氧化应激反应。过量的ROS促进脂质过氧化反应形成过氧化物，导致脂质代谢异常，并引发血液流变学改变，促进血管平滑肌的增殖，改变炎症细胞的迁移行为，破坏血管内皮细胞的稳定性和完整性［7］。MDA是ROS与细胞膜或者细胞内的不饱和脂肪酸反应生成过氧化脂质的过程中所产生的另外一种代谢产物，能够反映出细胞内过氧化脂质生成的量与速度。氧化应激损伤是形成心肌缺血症的重要病理原因之一［8-9］。在本研究结果中，OGD细胞模型出现ROS、MDA，以及促炎因子TNF-α、IL-6浓度明显升高的情况，而经替罗非班或（和）PI3K抑制剂处理后，OGD心肌细胞ROS和MDA、TNF-α、IL-6浓度均显著下降，且提示替罗非班对OGD心肌细胞的损伤和氧化应激有显著的保护作用。

Yang等［10］研究证明，在兔的离体心脏缺血再灌注实验中，以PI3K信号通路阻断剂处理后，心肌梗死显著增加，证明PI3K信号通路在心肌缺血再灌注中起到了关键的保护作用。同时，用LY294002作为抑制剂阻断，可见AKT的磷酸化水平降低，且AKT对心肌缺血再灌注的损伤保护作用也消失。因此，作者认为，PI3K可以通过促使其下游的AKT磷酸化而对心肌缺血再灌注的损伤发挥保护作用。在本研究中，替罗非班处理OGD心肌细胞后，炎症因子减少，标志着损伤水平的ANP、BNP浓度也降低，提示细胞损伤减少，替罗非班对OGD心肌细胞具有一定的保护作用。但本研究结果存在与其他研究不一致情况，相关研究显示PI3K抑制剂LY294002可加重缺血缺氧心肌细胞的损伤效应［11］，但是在本研究结果中，抑制剂对OGD心肌细胞ROS、促炎因子、ANP、BNP浓度均有一定的抑制效果，推测其原因可能与细胞状态、试剂差异、实验操作等有关。在鄂璐莎等［12］研究结果中，抑制剂LY294002可抵消高密度脂蛋白对PI3K/AKT信号通路的调控作用。本研究结果显示，替罗非班可缓解抑制剂LY294002对PI3K/AKT信号通路的阻断作用，减轻OGD细胞炎症因子及ROS水平。

综上，替罗非班对OGD心肌细胞具有显著保护作用，减轻其炎症反应和ROS水平，其机制可能与激活PI3K/AKT信号通路有关，但还需进一步实验进行验证。