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皮肤扁平苔藓组织miRNA-138及其靶蛋白表达

2021-05-08李媛媛王君杨培张翠苹王莹莹

青岛大学学报(医学版) 2021年1期
关键词:细胞周期试剂盒标本

李媛媛 王君 杨培 张翠苹 王莹莹

[摘要] 目的 探讨miRNA-138(miR-138)及其相关靶蛋白细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、P53在皮肤扁平苔藓(LP)中的表达。方法 收集活检切取的LP病人皮损组织标本40例(LP组),选取同期美容外科手术切除的正常皮肤组织标本35例作为对照组,采用RT-PCR法检测两组标本miR-138表达,ELISA法检测Cyclin D1、P53蛋白表达。应用Spearman秩相关检验分析miR-138表达与Cyclin D1、P53表达之间的相关性。结果 与对照组比较,LP组Cyclin D1、P53蛋白表达明显升高(t=-2.257、-2.217,P<0.05),miR-138表达下调(t=2.473,P<0.05)。Spearman秩相关分析显示,LP皮损组织miR-138表达与Cyclin D1、P53呈负相关(r=-0.248、-0.264,P<0.05)。结论 miR-138可能在皮肤LP的发病机制中起重要作用。

[关键词] 扁平苔藓;微RNAs-138;细胞周期蛋白D1;基因,p53

[中图分类号] R758.65[文献标志码] A[文章编号] 2096-5532(2021)01-0133-03

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression of miRNA-138 (miR-138) and its related target proteins cyclin D1 and P53 in skin lichen planus (LP). MethodsForty skin lesion tissue specimens were collected from biopsies in LP patients (LP group), and 35 normal skin tissue specimens from cosmetic surgeries in the same period were collected as control group. RT-PCR was used to determine the expression of miR-138 in the two groups, and ELISA was used to determine the expression of cyclin D1 and P53 proteins. The Spearman rank correlation test was used to analyze the correlation of miR-138 expression with cyclin D1 and P53 expression. ResultsCompared with the control group, the LP group had significantly increased expression of cyclin D1 and P53 proteins (t=-2.257 and -2.217,P<0.05) and significantly down-regulated expression of miR-138 (t=2.473,P<0.05). The Spearman rank correlation analysis showed that miR-138 expression in the skin lesion tissue of LP was negatively correlated with cyclin D1 and P53 (r=-0.248 and -0.264,P<0.05). ConclusionmiR-138 may play a key role in the pathogenesis of skin LP.

[KEY WORDS]lichen planus; microRNA-138; cyclin D1; genes, p53

扁平苔蘚(LP)是一种病因不明的慢性炎症性皮肤病,人群发病率低于1%[1],主要累及皮肤和黏膜。其典型病理表现为基底细胞液化变性及真皮上部炎症细胞浸润带[2]。MicroRNA(miRNA)不易被血清中核糖核酸酶降解,在血液和组织中稳定存在[3-4],在炎症、代谢和发育过程中发挥重要功能。miRNA-138(miR-138)是miRNA家族一员,有研究表明miR-138在口腔扁平苔藓(OLP)中表达降低[5]。细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、p53是miR-138的靶基因。miR-138及其靶蛋白Cyclin D1、P53是否在皮肤LP的发病机制中发挥作用尚不清楚。本研究旨在探讨miR-138及其靶蛋白Cyclin D1、P53在皮肤LP病变组织中的表达及意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料

2018 年10月— 2020年3月,选取我院皮肤科收治的LP病人皮损组织标本40例(LP组),病人临床表现典型并经组织病理学检查确诊为皮肤LP。选取同期我院美容外科手术切除的正常皮肤组织标本35例作为对照组。两组均排除其他系统性疾病,均未使用糖皮质激素治疗。

1.2 RT-PCR方法检测miR-138的表达

使用Trizol(日本Takara公司)从皮肤组织样本中分离出总RNA,第一链cDNA使用Mir-XTMmiRNAFirstStrandSynthesisandTBGreen试剂盒(Takara Bio USA, Inc)合成,实时PCR定量使用TB Green Premix Ex TaqTM Ⅱ试剂盒(TaKaRa)进行。采用2-△△CT法计算目的基因的相对表达水平。miR-138引物(F:5′-AGCTGGTGTTGTGA-ATCAGGCCG-3′,R:5′-GTATCAACGCAGAGT-ACTTT-3′)、U6引物(F:5′-GGAACGATACAG-AGAAGATTAGC-3′,R:5′-TGGAACGCTTCAC-GAAATTGCG-3′)均由上海生工公司合成。

1.3 ELISA法检测Cyclin D1、P53蛋白表达

应用Cyclin D1 ELISA试剂盒(江莱生物公司)、人肿瘤蛋白P53 ELISA试剂盒(Elabscience Biotechnology 公司)检测标本Cyclin D1、P53蛋白含量,根据试剂盒说明书进行操作,同时设置空白对照孔。用酶标仪检测450 nm波长处各孔吸光度,绘制标准曲线,计算Cyclin D1、P53的表达水平。

1.4 统计学分析

应用SPSS 22.0软件进行统计学分析,计量资料结果以±s形式表示,组间比较采用独立样本t检验。相关性分析采用Spearman秩相关分析法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组皮肤组织各指标检测结果比较

与对照组相比,LP组miR-138表达降低,差异有显著性(t=2.473,P<0.05);CyclinD1、P53蛋白表达显著升高,差异有显著性(t=-2.257、-2.217,P<0.05)。见表1。

2.2 miR-138与Cyclin D1、P53表达的相关性

Spearman秩相关分析显示,miR-138表达与Cyclin D1表达、P53表达均呈负相关(r=-0.248、-0.266,P<0.05)。见图1、2。

3 讨论

LP是一种慢性炎症性皮肤病,病程长,容易复发,常伴有瘙痒。其病因尚未明确,可能与遗传、免疫、感染、精神因素等相关。既往关于miRNA与LP相关性研究主要集中在OLP,针对皮肤LP的研究相对较少。本研究主要检测miR-138及其下游靶蛋白Cyclin D1、P53在皮肤LP中的表达,探讨其在LP发病中的意义。

由于miRNA不易被血清核糖核酸酶降解,在血液和组织中能够稳定存在,因此可用作临床诊断和疾病监测的生物标志物。WANG等[6]研究显示,miR-138表达水平升高可抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,并且降低MMP-2和MMP-9的表达。ZHOU等[7]的研究结果显示,miR-138通过抑制MMP-2和MMP-9的表达降低了骨原性肉瘤细胞的侵袭。MMP-2、MMP-9是基质金属蛋白酶(MMPs)家族成员,MMPs能够降解细胞外基质的多种成分,在炎症反应、组织愈合、组织重构以及肿瘤的侵袭与转移等过程中发挥重要作用。研究显示,MMPs与LP的发病有关[8-10]。另有研究发现,miR-138下调导致Th1/Th2失衡,参与了银屑病的发病机制[12]。Th1/Th2平衡失调与LP发病密切相关[13]。本文研究结果显示,皮肤LP组织中miR-138表达下调,推测miR-138异常表达与LP发病相关。

细胞增殖、分化与凋亡间的动态平衡与细胞周期的正常运行密切相关。对LP病变中细胞的增殖状况以及细胞增殖与凋亡关系进行研究,将有助于揭示该病的发病机制。Cyclin D1是LP病变中与细胞增殖有关的基因,p53是LP病变中主要与细胞凋亡有关的基因。本文研究结果显示,Cyclin D1、P53蛋白在皮肤LP中表达升高,推测Cyclin D1、 P53可能通过破坏角质形成细胞增殖与凋亡之间的平衡关系,促进细胞增殖,诱导细胞凋亡,进而在LP发病机制中发挥重要作用。

GHALLAB等[5]研究结果显示,OLP病人标本中miR-138表达明显下调,Cyclin D1基因和蛋白均过表达,二者表达呈负相关。双荧光素酶报告基因实验证实Cyclin D1是miR-138的靶基因[14]。Cyclin D1是细胞增殖过程中意义最大的细胞周期蛋白,在细胞周期控制中发挥重要调节作用[15]。既往有研究显示,Cyclin D1可能参与OLP和LP的发病机制[16]。本文研究结果显示,LP病人皮损组织中miR-138表达减少,Cyclin D1表达上调,二者呈负相关,差异有统计学意义。推测miR-138低表达通过调控其靶蛋白Cyclin D1诱导细胞增殖,可能在LP的发病机制中起着关键作用。

P53是参与细胞增殖和凋亡的众多蛋白之一。双荧光素酶报告基因实验显示p53是miR-138的靶基因。有研究发现,P53在OLP和LP中表达升高[17-18]。既往对细胞凋亡异常的研究主要集中在OLP,而对LP与凋亡的相关性研究相对较少。在细胞的正常发育过程中,由于P53半衰期短,所以蛋白水平较低;细胞在应激状态下,其表达升高从而阻滞细胞周期和促进细胞凋亡。本文研究结果显示,LP病人皮损组织中miR-138表达减少,P53表达上调,二者呈负相关,差异有统计学意义。推测miR-138表达下调会减弱对P53的抑制作用,从而诱导细胞凋亡,进一步证明miR-138的异常表达与LP发病相关。

综上所述,miR-138表达降低可能通过调控Cyclin D1、p53基因表达,破坏角质形成细胞的增殖与凋亡之间的平衡关系,促进细胞增殖、诱导细胞凋亡,在LP的发病机制中发挥重要作用。

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(本文編辑 黄建乡)

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